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背景:急性肾损伤（acute kidney injury,AKI）是一组临床综合征,以往称急性肾衰竭（acute renal failure,ARF）,急性肾损伤不仅会使重症患者的死亡风险上升,同时也会使发生慢性肾脏病和心血管疾病的风险上升。每年约有1330万人发生急性肾损伤（AKI）,其中约85%来自发展中国家,并与高死亡率和高发病率[1,2]有关。急性肾损伤主要的病理机制包括自由基损伤、细胞内钙超载、炎性反应和细胞凋亡这几个方面。研究人员越来越多地认识到,细胞凋亡在急性肾损伤中发挥着重要的作用。几种常见的肾脏损伤包括缺血、毒性损伤、辐射和输尿管梗阻都可以导致肾脏细胞凋亡。细胞凋亡过程由多种基因参与调控,抑制细胞凋亡的治疗干预措施可以减少肾功能障碍,加速急性肾损伤后的恢复。以抑制细胞凋亡为靶点进行研究或许是降低肾缺血再灌注损伤的有效途径。随着对circ RNAs研究的不断深入,circ RNAs已被确定为肾脏疾病新的治疗靶点和生物标志物。虽然许多circ RNAs已经在肾脏组织中被证实,但它们在疾病发展过程中的表达谱和潜在作用在很大程度上仍不清楚,仍需要进一步探讨其在急慢性肾脏疾病中的作用及其机制。未来的研究应该确认circ RNA与特定蛋白质和其他非编码RNA相互作用的确切机制。目的:探究环状RNA circLRIG1在缺血再灌注肾损伤中的表达变化,以及其在肾小管上皮细胞缺氧复氧过程中的作用和潜在机制,为急性肾损伤的预防和治疗提供理论依据和治疗靶点。研究方法:一、急性肾损伤关键分子circLRIG1的筛选及功能验证1.筛选出急性肾损伤患者血液中上调的环状circ RNA进行人鼠同源性比较,选取同源性最高的circLRIG1,采用琼脂糖凝胶电泳实验,放线菌素D实验和RNase R酶消化实验进行环状结构的验证。2.circLRIG1在肾小管上皮细胞缺氧复氧模型中和缺血再灌注肾损伤动物模型中的表达（1）构建肾小管上皮细胞缺氧复氧模型方法:将HK-2细胞分为缺氧/复氧组（I/R）和对照组,在缺氧/复氧前将完全培养基替换为无糖无血清培养基。将缺氧/复氧（I/R）组细胞置于缺氧培养箱（5%CO2、1%O2和94%N2）,12小时后转入常氧培养箱。对照组细胞在常氧条件下生长,无需更换培养基。（2）构建肾缺血再灌注动物模型方法:Balb/c小鼠随机分为假手术组（control组）和缺血再灌注肾损伤模型组（I/R组）,分别于术后0、24、48、72小时分为4组,每组6只。I/R组背部切口用弯头镊子将双侧肾蒂钝性分离,使用无创性微血管夹夹闭双侧肾蒂维持35分钟。control组:麻醉、固定及开腹同前,仅暴露及游离双侧肾蒂,不夹闭肾蒂。BUN,Scr检测,HE染色,检测肾缺血再灌注动物模型构建成功。（3）qPCR检测肾小管上皮细胞缺氧复氧模型,肾缺血再灌注动物模型中circLRIG1的表达。3.circLRIG1在缺血再灌注肾损伤过程中的功能验证（1）沉默circLRIG1细胞模型的构建设计了人源circLRIG1靶向性小干扰RNA（si RNA）,按照si-RNA浓度为50n M转染4-6小时后,换完全培养基,将si-circLRIG1转染至HK-2细胞。（2）沉默circLRIG1的缺氧复氧HK-2细胞模型中,CCK8检测细胞活力。流式细胞术,TUNEL染色检测细胞的凋亡率。Western blot检测凋亡相关蛋白BAX、BCL-2、Caspase-3表达水平,和炎症相关蛋白TNF-α、IL-6及IL-1β表达水平。二、circLRIG1通过吸附mi R-1263调控ADAM12的机制研究1.circLRIG1下游吸附的mi RNA的分子生物信息的筛选和预测荧光原位杂交技术（FISH）检测circLRIG1在细胞内分布。circbank和targetscan网站预测circLRIG1下游可能结合的mi RNA。2.circLRIG1调控mi R-1263的鉴定（1）将HK-2细胞分为正常HK-2细胞组（NC）,缺氧复氧模型组（I/R）,q PCR检测各组mi R-1263的表达情况。（2）将小鼠分为肾缺血再灌注模型组（AKI）和对照组（control）,q PCR检测各组mi R-1263的表达情况。（3）HK-2细胞中分别过表达和沉默circLRIG1,q PCR检测mi R-1263的表达量;过表达和沉默mi R-1263,q PCR检测circLRIG1的表达量。（4）荧光原位杂交实验验证circLRIG1和mi R-1263的共定位。荧光素酶报告基因验证circLRIG1和mi R-1263直接结合。3.mi R-1263下游靶基因的筛选及鉴定（1）targetscan和mi Rdb分别预测与mi R-1263直接结合的基因。q PCR检测过表达mi R-1263的HK-2细胞上述预测到基因的m RNA相对表达量,其中ADAM12表达变化最明显。（2）q PCR检测ADAM12在I/R细胞和动物模型中的表达水平。免疫组化检测ADAM12在I/R动物模型中的表达变化。（3）HK-2细胞中分别过表达和抑制mi R-1263,q PCR检测ADAM12表达变化。采用Western blot检测过表达mi R-1263的肾小管上皮细胞的ADAM12的表达量。（4）双荧光素酶报告基因的检测验证mi R-1263是否能和ADAM12直接结合。三、circLRIG1通过吸附mi R-1263调控ADAM12的功能验证1.沉默circLRIG1后同时抑制mi R-1263或回补ADAM12对I/R细胞增殖和凋亡水平的影响（回复实验）（1）转染效率的验证为了验证沉默circLRIG1,抑制mi R-1263以及回补ADAM12的转染效率,我们将HK-2细胞分为空白对照组（Blank）,转染空白质粒组（si RNA-NC）,沉默circLRIG1组（si-circLRIG1）,沉默circLRIG1+mi R-1263抑制剂组（si-circLRIG1&mi R-1263 inhibitor）和沉默circLRIG1+过表达ADAM12组（si-circLRIG1&pc DNA3.1ADAM12）,q PCR分别检测circLRIG1,mi R-1263,ADAM12的表达量。（2）CCK-8检测回复实验中各组增殖水平变化;流式细胞仪,TUNEL检测回复实验中各组凋亡率变化;免疫印迹检测回复实验中各组BAL,BCL-2,caspase-3表达变化。2.在体尾静脉注射肾脏特异性AAV2/9腺相关病毒,观察沉默circLRIG1对缺血再灌注肾损伤肾组织的影响（1）AAV-circLRIG1-sh腺相关病毒注射入小鼠体内沉默效率的验证。（2）将沉默circLRIG1的小鼠构建肾缺血/再灌注模型,分为沉默circLRIG1病毒组（AKI-AAV-circLRIG1-sh）和病毒空载组（AKI-AAV-NC）。（3）在沉默circLRIG1的AKI小鼠肾组织中检测以下指标:RT-q PCR法检测mi R-1263,ADAM12表达水平。免疫组化检测血尿素氮（BUN）水平,肌酐（Scr）水平,肾小管间质半定量评分。免疫组化检测BAX,BCL-2,cleaved caspase-3的表达水平。研究结果:一、circLRIG1为环状结构,在肾小管上皮细胞缺氧复氧模型中和缺血再灌注肾损伤动物模型中表达上调,沉默circLRIG1促进缺氧复氧肾小管上皮细胞增殖,抑制凋亡,降低炎症水平1.circLRIG1的人鼠同源性为83.7%,琼脂糖凝胶电泳,放线菌素D实验,RNase R酶消化实验证实circLRIG1为环状结构。2.HK2细胞缺氧复氧模型组（I/R）circLRIG1表达水平显著增高（p<0.001）。肾缺血再灌注动物模型中circLRIG1表达显著增高,且随着时间的延长,circLRIG1表达量逐渐增加（p<0.05）。3.在circLRIG1 si RNA转染后的HK-2细胞中,CCK8结果显示,沉默circLRIG1组细胞活力显著增加（p<0.05）。流式细胞仪,Tunel结果显示,沉默circLRIG1组的细胞凋亡水平显著下降（p<0.05）。蛋白免疫印迹结果显示,沉默circLRIG1组的细胞凋亡相关蛋白BAX、Caspase-3蛋白表达明显下降,BCL-2蛋白表达升高（p<0.05）。4.蛋白免疫印迹结果显示,沉默circLRIG1组的炎症相关蛋白TNF-α、IL-6及IL-1β蛋白表达降低（p<0.05）。二、circLRIG1通过吸附mi R-1263调控ADAM12的机制研究1.circLRIG1在细胞核和细胞质中均有表达。在circbank及circinteractome网站进行生物信息学预测mi R-1263均可以与circLRIG1结合。2.mi R-1263在I/R细胞和动物水平表达下调,circLRIG1可以负向调控mi R-1263,circLRIG1和mi R-1263直接结合q PCR结果显示,缺氧复氧HK2组mi R-1263表达量降低（p<0.001）;缺血再灌注肾损伤动物模型中,mi R-1263表达量随着缺血时间的延长而降低（p<0.05）。沉默circLRIG1后,mi R-1263的表达量显著增加（p<0.01）。过表达circLRIG1,mi R-1263的表达量显著降低（p<0.001）。沉默mi R-1263后,circLRIG1的表达量显著增加（p<0.01）。过表达mi R-1263,circLRIG1的表达量显著降低（p<0.01）。提示在HK-2细胞中circLRIG1可以负向调控mi R-1263,mi R-1263可以影响circLRIG1。FISH结果显示circLRIG1与mi R-1263在肾小管上皮细胞中的细胞质中存在着明显的共定位情况（黄色荧光）。双荧光素酶报告基因验证circLRIG1和mi R-1263直接结合。3.ADAM12在I/R细胞和动物水平表达上调,mi R-1263负向调控ADAM12表达,mi R-1263和ADAM12直接结合targetscan和mi Rdb分别预测取交集得到10个可以与mi R-1263直接结合的基因。HK-2细胞中过表达mi R-1263,ADAM12的表达量降低最明显（p<0.005）。缺氧复氧的HK2细胞中ADAM12的表达量显著升高（p<0.05）,I/R动物模型中ADAM12的表达量显著升高（p<0.001）。过表达mi R-1263后ADAM12表达量明显降低（p<0.001）,抑制mi R-1263后ADAM12表达量显著升高（p<0.001）。ADAM12的蛋白表达量随着mi R-1263 mimics转染浓度的增加而逐渐下降（p<0.001）。沉默circLRIG1后ADAM12表达量显著降低（p<0.05）,双荧光素酶报告基因验证mi R-1263和ADAM12直接结合。三、circLRIG1通过吸附mi R-1263调控ADAM12的功能验证1.在缺氧复氧的HK-2细胞模型中,沉默circLRIG1促进细胞增殖,抑制凋亡,当同时抑制mi R-1263或回补ADAM12时,促进细胞增殖和抑制凋亡的作用被回复CCK-8检测结果显示:沉默circLRIG1后细胞活力增加,沉默circLRIG1后同时抑制mi R-1263,细胞活力再次降低（p<0.05）。沉默circLRIG1后过表达ADAM12,细胞活力再次降低（p<0.01）,沉默circLRIG1促进细胞增殖的作用被回复。流式细胞仪,TUNEL法,western blot检测结果显示:沉默circLRIG1后细胞凋亡水平下降,沉默circLRIG1后同时抑制mi R-1263,发现细胞凋亡水平再次升高（p<0.05）,沉默circLRIG1后过表达ADAM12,发现细胞凋亡水平再次升高（p<0.05）,沉默circLRIG1的抑制凋亡作用被回复。2.在体尾静脉注射AAV2/9腺相关病毒沉默circLRIG1,可以减轻缺血再灌注肾损伤沉默circLRIG1的AKI小鼠较空载病毒的AKI小鼠血尿素氮,肌酐降低,肾小管损伤评分明显降低,HE染色肾损伤减轻。肾组织mi R-1263表达水平显著上调。ADAM12表达水平显著下调。BAX,cleaved caspase-3染色强度显著下降,BCL-2染色强度显著增加。研究结论:1.circLRIG1在缺血再灌注肾损伤细胞模型和动物模型中表达上调。体外研究证实在缺血再灌注肾损伤过程中沉默circLRIG1能够促进细胞增殖和抑制凋亡。2.体外研究证实了肾小管上皮细胞缺氧复氧过程中circLRIG1负向调控mi R-1263,mi R-1263负向调控ADAM12,证实了circLRIG1-mi R-1263-ADAM12调控轴的存在。3.体外研究证实肾小管上皮细胞缺氧复氧过程中circLRIG1是通过circLRIG1-mi R-1263-ADAM12轴调控细胞增殖和凋亡。体内研究证实沉默circLRIG1在缺血再灌注肾损伤过程中可以降低凋亡水平,减轻肾损伤。