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牛巴氏杆菌病又称牛出血性败血症,简称牛出败,(Haemorrhagic septicaemia of cattle,HSC),是由多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)引起的普遍流行于牛和水牛的高致病性、高死亡率传染病,对养牛业构成严重威胁。国内引起牛出败的病原菌主要为荚膜血清A群及B群的Pm菌株,而目前有关两种血清型致病机制的区别尚不清楚。2016年末本实验室收到北京和山东两个奶牛场送检的各1头病死成年牛组织,通过将病死牛组织感染小鼠,小鼠死亡后取组织染色镜检、接种血清TSA和麦康凯培养基,分离到2株疑似多杀性巴氏杆菌,命名为Pm1和Pm2。经细菌培养特性及形态检验、生化试验、16S rRNA基因测序、多杀性巴氏杆菌种特异性PCR、荚膜A、B血清群特异性PCR、脂多糖基因分型PCR、荚膜A群透明脂酸抑制试验鉴定其为荚膜血清A群、脂多糖3型多杀性巴氏杆菌。为探究A、B两种血清群的差异,本课题利用RNA-seq技术对荚膜血清A群菌株Pm1与B群菌株CVCC448转录组测序并进行了系统分析。结果发现,两株菌株的同源基因中有810个显著差异基因,B群菌株相对于A群菌株有506个基因下调,有304个基因上调。GO功能富集分析表明,B群菌株与A群菌株主要差异存在于细胞膜表面,而细胞膜表面众多成分在细菌入侵宿主时发挥重要作用,提示两者的致病能力不同。此外两者的差异基因也广泛存富集于ABC转运通路,预示着两个血清型菌株在能量代谢方面有所差异,而代谢活动可能会影响细菌毒力。基于转录组测序结果,进一步利用免疫沉淀技术(pull-down),筛选到牛源Pm优势抗原,通过质谱与生物信息学分析,选取了外膜脂蛋白载体蛋白LolB(outer membrance lipoprotein LolB)作为候选抗原,根据GenBank多杀性巴氏杆菌LolB基因核苷酸序列(Gene ID:CP003022.1)设计了一对去信号肽特异性引物,通过基因的克隆、表达,成功构建了pET28a-LolB与pMAL-LolB载体并在工程菌BL21(DE3)中表达,经可溶性鉴定,His-LolB重组蛋白以包涵体形式存在,而MBP-LolB重组蛋白以包涵体与可溶性形式存在,考虑到蛋白复性困难,因此将可溶性蛋白纯化,获取纯度较高的MBP-LolB蛋白,经Western Bolt鉴定,重组蛋白LolB能与全菌灭活苗免疫血清产生特异性反应。将MBP-LolB作为抗原包被ELISA板,初步建立了间接ELISA诊断方法。通过棋盘法确定了抗原最佳包被浓度为0.125ug/mL,待检血清最佳稀释度为1:100,HRP标记的兔抗牛IgG最佳稀释度为1:10000。该ELSA方法对Pm标准阳性的检测敏感性为1:400,而对牛病毒性腹泻病毒、牛副结核病毒、牛白血病病毒、牛布氏杆菌病阳性血清阳性血清均检测为阴性,说明它具有良好的特异性。以该ELISA方法对来自北京昌平地区奶牛场90份血清样品进行检测,结果均为阴性,说明该地区奶牛场尚未受到Pm感染。总之,本研究通过细菌分离鉴定,转录组学测序以及免疫沉淀技术探究了荚膜血清型A群和B群菌株之间的差异,成功筛选到其优势抗原基因LolB基因,并以此获得重组蛋白进一步建立了间接ELISA方法,为将来研制牛多杀性巴氏杆菌的诊断技术奠定了基础。