研究背景长期以来,骨科医生、学者普遍认为软骨因为缺少血管和淋巴管等组织,其缺损后难以自愈,需要对其进行积极治疗,力求能够恢复其结构和功能。目前来看,临床现有的治疗方法包括关节腔内注射(药物或生物制品)、微骨折术和钻孔术、自体软骨细胞移植、骨-软骨移植术、马赛克技术以及最终的关节置换术等手段。虽然方法众多,但这些治疗方法均有各自的优缺点和适应症,在结构和功能上,运用上述方法重建和修复后的关节软骨与正常关节软骨仍存在一定的差异。因此,探索出一种能够彻底治愈这类疾患的技术和方法是亟待解决的问题,也是当前骨科基础和临床研究的热点和难点之一。生物治疗、组织工程学和再生医学研究的不断进步为能够彻底治愈关节软骨缺损和改善缺损修复后的关节软骨结构和功能提供了一个可行、有效的思路。应用细胞外基质材料、仿生材料以及人工合成材料构建支架系统作为种子细胞和细胞因子的载体,从而在体内和体外构建组织工程化组织,是当前组织工程研究的核心内容之一。由于自体或异体基质来源的支架的材料来源相对短缺以及同时可能带来的疾病传播风险问题,加上生物力学性能欠佳等不足,在一定程度上限制了它的广泛应用。近来,具有容易获取和可塑性强特点的人工合成生物可降解材料逐渐受到研究者的亲睐。已有人工合成的PLGA支架用于软骨、骨组织、肌腱以及韧带等缺损修复和重建的研究报道。考虑到正常组织的再生和修复过程中,需要众多细胞因子的参与和协同作用,因此将一定浓度不同种类的细胞因子负载于软骨缺损的部位以促进其自身修复的过程是必要的。目前已有学者通过负载不同的重组细胞因子进行重建组织工程骨-软骨缺损的实验研究,并且获得了较理想的结果,但是,依然存在一些不足之处。例如单一的细胞因子难以真正模拟组织再生修复过程中需要多种生长因子协同的生理机制,而且在体内降解迅速。另外,细胞因子或生长因子的价格比较昂贵,可供临床选择的种类依然较少。近年来,富血小板血浆(platelet-rich plasma, PRP)因激活后可释放血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor PDGF),转化生长因子(transforming growth factor-β TGF-β),血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor VEGF),胰岛素生长因子(insulin growth factor IGF)以及成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor b-FGF)等而广受关注。PRP是自体的生长因子的重要来源,具有容易获得,避免疾病传播风险、价格低廉以及含有多种组织需要的生长因子等优点。研究结果表明PRP可以提高间充质干细胞(mesenchymal stem cells MSC)等增殖能力并促使其向成软骨方向分化；PRP还可以促进软骨下骨内的祖细胞的迁移和成软骨分化。动物实验研究结果表明PRP联合MSCs可以促进骨组织的形成同时在骨软骨修复中具有积极作用。骨髓来源的MSCs可以方便地获取和进行体外扩增,并且具有多向分化潜能。因此,BMSCs是通过组织工程技术构建骨-软骨复合体的较为理想的种子细胞之一。另外,通过采集大鼠的自体外周血制备PRP,可以获取自体来源的多种生长因子,从而用于诱导BMSCs的增殖与分化并形成成熟的骨与软骨组织。富血小板血浆(PRP)作为一种新兴的生物疗法来治疗软骨损伤和关节内应用来治疗膝关节疼痛。基础研究表明PRP通过软骨细胞和骨髓来源的间叶层干细胞来增强细胞增生和软骨基质合成,并且通过滑膜细胞增加透明质酸的合成。在临床前的动物实验中,PRP延缓骨性关节炎的进展,但是关于其对于软骨或骨-软骨缺损的治疗效果报道不一。临床研究表明PRP联合骨髓来源的基质干细胞能够促进软骨缺损的修复。另外,在关节腔内注射PRP,1年后的随访发现,这些遭受膝关节疼痛的患者也能够从中受益。尽管大部分的研究支持PRP在临床上应用治疗软骨损伤和关节疼痛,但对PPR分型策略和对PRP制剂内容物更广泛的测试和报道将会对PRP治疗方案的发展有所帮助。成年关节软骨缺乏软骨下营养通路,其营养供给主要是通过关节活动产生的压力变化,从而促使滑液在关节腔与软骨基质之间进行交流。研究表明,制动可导致关节软骨退变,但对于这一改变的发生机理看法不统一。传统观点是[1]关节制动后,需要关节活动来推动的软骨内外滑液流动发生障碍,软骨本身的物质交换受到影响,从而影响软骨细胞自身的代谢,最终发生退行性改变。但Palmoskin证实低应力可导致软骨正常成分改变。顾延等发现制动后关节软骨退变不仅与关节活动丧失有关.它可能同制动后关节软骨表面应力异常的关系更为密切。为此,他们提出两种猜测：(1)“软骨泵”营养机制需要关节活动和一定量应力的共同维持,如果缺乏足够的应力,即使保留关节活动,软骨仍不能有效地获取营养。(2)软骨细胞自身存在应力感受装置,软骨细胞进行正常的生理活动需要一定量的应力刺激。制动后关节内软骨表面应力异常,除有持续静止应力存在外,软骨表面缺乏应力刺激,而持续低应力本身即可导致软骨退变。Salter等人研究了持续的被动活动对兔软骨愈合的影响[2],发现：关节活动对关节表浅的缺损修复无明显益处,但持续的被动活动能促进较小的全层软骨缺损修复,最终能够产生一种在形态上和组织学上与透明软骨相似的组织,该组织在耐久性和生物力学方面比固定或间歇主动活动产生的修复组织更具优势。但他仅进行了最多四周的观察,我们知道,正常的软骨全层缺损修复时序为4-8周出现透明软骨,约在12周时开始退化,随着时间的推移,修复的软骨组织是否会退变,目前还不得而知。持续的关节制动最终导致不可逆的损害包括关节周围致密纤维组织和作用于关节的肌肉挛缩,关节软骨丢失和关节间隙消失并被纤维脂肪组织填充。滑膜关节持续的负重和活动减少可引起关节软骨的改变,这与关节周围致密纤维组织的改变是同时的：软骨细胞改变合成活动,软骨蛋白多糖浓度减少,基质有机构成可能减少并且伴有力学特性的退变。尽管对于制动的关节进行重复的肌肉收缩可能帮助保护软骨,正常滑膜关节结构,组成和功能的维持需要负荷和运动的共同作用。软骨改变在关节运动持续性减少后很快发生。六周或更长时间的石膏制动,减少软骨厚度,糖醛酸含量和蛋白多糖合成并减弱蛋白多糖形成聚合物的能力。停止制动并在小栅栏里进行3周的活动可以逆转这些改变。停止制动后跑步机锻炼阻止这些逆转的改变表明软骨剧烈的和频繁的负重阻碍修复。现在普遍认为,关节软骨细胞的正常生理功能与其受到的正常应力刺激密切相关,运动能够帮助改善修复软骨的质量。制动和关节负荷加重均导致关节软骨退行性改变[3]。Rubak[4]等发现进行早期活动对骨膜移植后的全层软骨缺损修复有利。由此看来,合适的力学环境对维持关节软骨的正常结构意义重大。软骨细胞对力学刺激敏感,稳定的过大的压力将抑制软骨细胞基质蛋白的合成,而周期变化压力则可刺激其合成。因此适当的关节活动对软骨营养传递非常重要。关节活动所形成的关节软骨表面受压与减压节律性出现,形成所谓“软骨泵”的软骨营养机制。适当运动可以降低关节内压力,促进滑液向软骨表面和细胞间质弥散,提供软骨修复的良好内环境,促进软骨修复。已有学者研究了不同运动强度对膝关节软骨的影响,大部分结果显示中等强度运动对软骨的修复是有利的,同时高强度运动会加重软骨的退变,而低强度运动对软骨修复无明显促进作用。上述的研究支持了适当运动对软骨损伤修复的积极作用,并且在运动强度的选择上给出了文献支持。我们设想,软骨细胞合成、分泌软骨基质的过程受到应力大小的调控,当软骨细胞缺乏足够应力刺激时,就会出现合成与分泌功能下降,以及随之而来的软骨细胞退变。全层软骨缺损修复的机制为：软骨下骨的出血使缺损区内形成血肿,同时基底部松质骨内间充质细胞增殖,缺损区被纤维素凝块填充,凝块进一步机化,形成肉芽组织,肉芽组织化生成纤维软骨,最后向类透明软骨转变。因此我们认为早期的主动运动能够影响缺损区血肿的形成及骨髓间叶干细胞的增殖,从而影响软骨缺损的修复。小的全层软骨缺损修复有如下阶段[5]：术后2天即见间充质细胞长入,4周左右出现纤维软骨,8周左右出现透明软骨,大约12周开始退化。本次实验在大鼠股骨髁间制造直径1mm的软骨缺损,目前认为小于3mm的全层软骨缺损可以自行修复,但修复的软骨同正常透明软骨相比,在结构成分、机械特性和耐久性上都较差。目前的研究主要集中在被动运动对软骨缺损修复的影响,主动运动对软骨缺损修复的作用较少报道。目的本实验拟在造模4周后,即缺损区出现纤维软骨时始进行中等强度的功能锻炼同时结合关节腔内PRP注射(术后第2周开始,连续3周,每周一次),以观察它们对软骨缺损修复重塑的影响。方法SPF级SD大鼠50只,其中15只用来提取富血小板血浆(PRP),其余35只SD大鼠分成5组：A空白对照组；B造模+自由活动组；C造模+主动运动组；D造模+PRP+自由活动组；E造模+PRP+主动运动组。Elisa法检测血清中MMP-3(血清基质蛋白酶3)、TIMP-1(金属蛋白酶组织抑制因子1)含量,免疫组化染色检测软骨中Ⅱ型胶原含量。结果大体观察、HE染色、免疫组化染色显示：软骨缺损后,缺损部位由纤维软骨替代,不能再生出透明软骨。生化指标MMP-3显示,A组与B组；B组与C组；B组与D组之间比较差异有统计学意义(P<0.05),表明造模后不加干预措施,软骨修复效果最差；而造模后进行中等强度主动运动或关节腔内注射PRP对软骨缺损修复是有利的。TIMP-1显示,A组与C组；A组与D组;C组与D组之间比较差异有统计学意义(P<0.05),表明TIMP-1在正常软骨中维持低水平,而伴随着软骨损伤修复的过程而增高；造模后进行中等强度主动运动对软骨缺损修复的效果较单纯注射PRP显著。而对TIMP-1和MMP-3求商后进行统计学分析也表明：造模后早期进行中等强度主动运动或(和)关节腔内注射PRP,对软骨缺损的修复是有利的,而尚不能证实干预因素主动运动和PRP之间有协同促进作用。结论软骨缺损后,早期进行中等强度的主动运动或(和)关节腔内注射PRP,对软骨修复有一定的促进作用,尚不能证实主动运动和PRP之间的协同促进作用。另外,软骨修复的远期效果还需要样本量更大、观察时间更长的实验进行验证。