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蜱是一类重要的医学节肢动物,可以吸食宿主血液传播病原体,是仅次于蚊子的第二大传染病媒介生物。蜱在我国分布广泛,可传播多种病原体,主要包括斑点热群立克次体、无形体、伯氏疏螺旋体、巴贝西虫等。近年来,随着对蜱以及蜱传病原体研究的深入,在我国已陆续发现多种新发蜱传病原体,并且对人致病,对于其造成的公共卫生问题不容忽视。因此掌握新发蜱传病原体的流行情况,以及对新发蜱传病原体进行快速、高灵敏和高特异性的识别,对于蜱传病原体的预防和控制具有非常重要的意义。目的1.建立快速、高灵敏性和高特异性的蜱传病原体荧光定量PCR检测方法。2.通过对采样地区蜱传病原体进行流行病学调查和病原体复合感染研究,发现新发蜱传病原体。通过序列比对和系统进化分析确定其进化地位,掌握当地新发蜱传病原体流行情况。方法1.采用MEGA7.0软件分别对斑点热群立克次体、无形体、伯氏疏螺旋体和巴贝西虫的多个基因序列进行比对,筛选保守区域。选取斑点热群立克次体omp A基因、无形体16Sr RNA基因,伯氏疏螺旋体fl A基因、巴贝西虫18Sr RNA基因作为靶基因,采用Oligo7.0软件针对上述病原体的保守区域设计引物和探针。构建4种单一蜱传病原荧光定量PCR检测体系,并对引物和探针的浓度进行优化,确定引物和探针的最适工作浓度。利用SAS9.0软件比较不同浓度的引物和探针的扩增效率,随之对检测体系的检测下限和交叉反应性进行测定。在构建的4种单一蜱传病原体检测体系的基础上,构建两种双重蜱传病原体荧光定量PCR检测体系,并对检测体系的检测下限进行测定。2.2021年3月～5月,分别在在我国广西省靖西市、浙江省舟山市、内蒙古自治区锡林郭勒盟和黑龙江省牡丹江市等地区采集蜱和宿主动物样本,并使用构建成功的双重蜱传病原体荧光定量PCR检测体系对收集的样本进行检测。3.利用普通PCR扩增阳性样本的特异性目的基因。将扩增产物进行测序后,利用CLC Genomics Workbench软件进行双端拼接。通过BLAST比对工具确定其与已知病原体基因的相似性。利用MEGA7.0软件构建系统进化树,确定其进化地位。结果1.用于检测斑点热群立克次体和无形体的单一荧光定量PCR检测方法的检测下限为1 copy/μL,用于检测伯氏疏螺旋体与巴贝西虫的单一荧光定量PCR检测方法的检测下限为10 copies/μL;用于检测斑点热群立克次体与无形体的双重荧光定量PCR检测方法和用于检测伯氏疏螺旋体与巴贝西虫的双重荧光定量PCR检测方法的检测下限均为10~2 copies/μL。2.从广西省靖西市、内蒙古自治区锡林郭勒盟、浙江省舟山市和黑龙江牡丹江市4个地区共采集324份样本,其中蜱样本269份,鼠样本55份。269份蜱样本中,斑点热群立克次体阳性样本数为210,阳性率为78.07%;无形体阳性样本数为2,阳性率为0.74%;伯氏疏螺旋体阳性样本数为12,阳性率为4.46%;巴贝西虫阳性样本数为3,阳性率为1.12%。55份鼠样本中,斑点热群立克次体阳性样本数为10,阳性率为18.18%;在鼠样本中未检测到其他三种病原体。3.系统进化分析结果显示,从324份样本中共检测出4种蜱传病原体,包括4种斑点热群立克次体（Rickettsia japonica、Rickettsia sp.JX、Rickettsia heilongjiangensis、Candidatus Rickettsia tarasevichiae）、2种无形体（Anaplasma phagocytophilum、Anaplasma sp.SFQ）、4种伯氏疏螺旋体（Borrelia valaisiana、Borrelia sp.JX、Borreliella afzelii、Borrelia garinii）、1种巴贝西虫（Babesia canis）。复合感染调查结果显示,1只粒形硬蜱中存在斑点热群立克次体、无形体和伯氏疏螺旋体的复合感染,2只粒形硬蜱存在斑点热群立克次体和伯氏疏螺旋体的复合感染,1只全沟硬蜱存在斑点热群立克次体和无形体的复合感染,9只全沟硬蜱中存在斑点热群立克次体和伯氏疏螺旋体的复合感染。结论1.本研究建立了4种单一荧光定量PCR检测技术和2种双重荧光定量PCR检测方法,病原体检测范围涵盖了9种斑点热群立克次体、7种无形体、5种伯氏疏螺旋体和10种巴贝西虫。该方法可以用于检测蜱样本和鼠样本,具有较高的实用价值。2.从广西省、内蒙古自治区、浙江省和黑龙江省的蜱样本和鼠样本中检测出4种蜱传病原体,包括4种斑点热群立克次体、2种无形体、4种伯氏疏螺旋体、1种巴贝西虫。在广西省靖西市样本中检测出1种新型斑点热群立克次体和1种新型伯氏疏螺旋体;在黑龙江省牡丹江市样本中检测出1种未曾在该地区发现的无形体。3.复合感染调查结果显示,蜱中存在多种蜱传病原体的复合感染,在广西靖西市和黑龙江牡丹江市均发现2～3种蜱传病原体复合感染情况,提示上述地区病原体种类复杂多样,值得深入研究。