阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease , AD)是一种中枢神经系统进行性变性疾病,临床症状可表现为进行性的认知损伤、注意力下降、记忆障碍、空间记忆缺失以及情绪失衡,生活自理能力丧失,严重危害着老年人的身体健康和生活质量。目前认为,AD是由遗传学因素、环境因素和代谢因素等多种因素,共同作用所引起的一种病理过程。其特征性病理改变为细胞外的老年斑(senile plaques,SP)沉积和神经元细胞轴突内的神经原纤维缠结,两者分别由β淀粉样蛋白(β-amyloid peptide, Aβ)和过度磷酸化的Tau蛋白组成。大量的研究证实,神经末梢的Aβ异常聚集可导致突触损伤和神经元的退行性病变。海马作为与学习记忆、空间认知等高级功能密切关联的重要脑区,也是AD病程中受累及的主要脑区之一。对海马病变的病理机制的深入研究必将有助于我们全面认识AD并为治疗提供有力线索。近年来,成年神经发生已在鸟类、爬行类、啮齿类、灵长类包括人类的不同种属间得到证实。一般认为,成年哺乳动物脑内的神经发生限于侧脑室的室下区和海马齿回(dentate gyrus,DG)的颗粒下区(subgranular zone,SGZ)。SGZ新生的神经元能迁移到颗粒细胞层并分化为成熟的颗粒神经元。海马是公认的与学习记忆相关的结构,而DG是海马回路的重要通路,与海马相关的学习任务训练能增加成年大鼠新生神经元数量。以学习记忆、认知功能障碍等为特征的AD病变中,成年海马神经发生是否异常以及其机制研究,这是近年来的研究热点。以往在不同AD病人和动物模型的研究中,观察到的海马成年神经发生出现增强或减弱的两种截然相反的报道。我们认为这种不一致性主要是由于AD患病人群的种群差异,家族性早发性AD与散发性AD的相关基因的表达差异,以及动物模型的遗传背景、动物品系等差异。目前对成年海马神经发生的调控机制的研究表明,局部微环境或者壁龛(Niche)控制神经发生。对神经干细胞(neural stem cells,NSCs)微环境的认识,在理解NSCs如何增殖、分化,最终整合到成熟的神经环路中有重要提示。从分子机制的角度看,有几个重要的微环境成分被提出。其中骨形成蛋白(bone morphogenetic protein,BMPs)和拮抗蛋白Noggin,已被证实是NSCs微环境的关键组成成分。BMP4是转化生长因子β蛋白家族中的一员,BMPs和它们的调节基因与早期胚胎发生相关,在细胞分化中起重要的的定向诱导作用。BMP4和noggin在出生后和成年中枢神经系统表达,提示BMP4和Noggin是NSCs正常分化所需微环境的关键成分,并可能在成年神经发生中也发挥重要的调控作用。已有的研究证实,Noggin与BMPs共同调控成年脑内室下区NSCs的分化。室下区室管膜细胞表达Noggin,拮抗BMPs信号作用而促进神经元产生。由此推测,室管膜通过产生Noggin来封闭内源性BMPs信号,为邻近的室下区干细胞提供有利于神经发生的微环境。Noggin和BMP4在出生后大鼠海马SGZ增殖区有表达。对于APPswe/PS1dE9转基因小鼠,成年海马齿状回NSCs的增殖与分化是否正常,神经发生异常与组织病变有无关联,微环境中有哪些重要信号分子参与成年海马神经发生,目前尚缺乏相关报道。另外,老年斑内Aβ1-42蛋白与活化的星形胶质细胞同样作为AD脑内微环境的重要组分之一,是否也参与了海马NSCs的“命运”转归的调控?机制怎样?我们推测,BMP4/Noggin、Aβ、星形胶质细胞在分子水平与细胞水平参与AD海马NSCs的异常成年神经发生的调节。本研究主要的实验内容:1. APPswe/PS1dE9小鼠成年海马神经发生水平下降。运用BrdU标记方法来观察APPswe/PS1dE9小鼠海马DG区神经干细胞的神经发生情况,并进一步观察APPswe/PS1dE9小鼠Morris水迷宫空间学习记忆行为及其特征性脑组织病理学变化。探讨APPswe/PS1dE9小鼠成年神经发生异常及其病理学、行为学的关联。结果显示:APPswe/PS1dE9小鼠在成年及老年期的海马神经发生水平下降。能够模拟AD主要病理特征的Aβ沉积、星形胶质细胞活化的老年斑结构,但无显著神经元丢失。老年期存在空间学习记忆能力障碍。结果提示,APPswe/PS1dE9小鼠成年海马神经发生下降与海马区Aβ淀粉样斑块的不断聚集存在显著的相关性。Aβ淀粉样蛋白可能参与了AD成年神经发生的异常。2. BMP4、Noggin分子参与调节APPswe/PS1dE9小鼠成年海马神经发生。采用原位杂交与免疫组化方法,观察APPswe/PS1dE9小鼠海马区BMP4和Noggin在mRNA和蛋白水平的表达情况,并且运用侧脑室注射Noggin蛋白来进一步观察海马区NSCs的增殖与分化的改变。探讨BMP4和Noggin在APPswe/ PS1dE9小鼠海马区的表达及其与成年海马神经发生的潜在联系。结果显示:BMP4 mRNA和蛋白质的高表达,Noggin的mRNA和蛋白质的低表达,都具有年龄依赖性,且二者之间具有显著的相关性。首次发现APPswe/PS1dE9小鼠海马BMP4的高表达与海马齿状回NSCs增殖能力的下降具有正相关性。Noggin的低表达与海马齿状回NSCs增殖能力的下降具有负相关性。并且运用Noggin嵌合蛋白拮抗BMP4作用,可促进APPswe/PS1dE9小鼠海马NSCs的增殖与分化。结果提示BMP4与Noggin可能协同参与海马神经发生的调控。原代分离纯化小鼠海马神经干细胞,添加不同浓度BMP4细胞因子,观察BMP4对NSCs的增殖与分化的影响。结果显示BMP4能抑制海马NSCs增殖,抑制其向神经元分化。进一步采用Noggin重组腺病毒感染神经干细胞,再加入BMP4细胞因子,以观察Noggin对NSCs的增殖和分化的影响。结果显示Noggin通过拮抗BMP4的作用,能有效促进海马NSCs的增殖,并促进其向神经元分化。3. Aβ、星形胶质细胞参与对海马神经干细胞增殖与分化的调控。成功分离原代星形胶质细胞和原代小鼠海马神经干细胞,利用Transwell共培养体系,分别观察Aβ、星形胶质细胞对NSCs的增殖与分化的影响。结果显示:在体外培养条件下,Aβ42蛋白和星形胶质细胞均可有效的诱导NSCs的细胞迁移,显著促进NSCs的细胞增殖与神经分化,但是以胶质分化为主。结果提示Aβ、星形胶质细胞可能在AD某一病程阶段,发挥正性作用,参与神经干细胞增殖与分化的调节。综上所述,本研究首次发现APPswe/PS1dE9小鼠的成年海马神经发生下降,这种异常发生状态与BMP4、Noggin在成年海马区的异常表达以及协同作用机制有密切关联。并经体外实验证实老化聚集的Aβ蛋白和活化的星形胶质细胞可以激发神经干细胞的增值与分化。这些结果提示了成年海马神经发生的下降可能是导致AD病变发生发展的重要机制之一,微环境因素也积极参与了干细胞巢神经发生的调控。本研究不仅更加深入的认识了AD成年海马神经发生的可能机制,而且为我们这些调控环节中寻求新的AD治疗靶点提供了更多理论知识。