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目的:基于MicroRNA-130a靶向调节Gax探讨复方薤白胶囊对肺动脉高压血管重构的作用。方法:1.健康雄性SD大鼠随机分为6组:对照组,模型组,阳性药物对照组,复方薤白胶囊低、中和高剂量组。对照组大鼠腹腔注射生理盐水,其他组大鼠腹腔注射野百合碱(MCT)(60 mg/kg)建立肺动脉高压(Pulmonary arterial hypertension,PAH)模型。在建模的第二天通过胃内给药,连续21天,对照组和模型组大鼠给予生理盐水,阳性药物对照组大鼠每日服用硝苯地平0.02g/kg;复方薤白胶囊低中高剂量组大鼠每天分别给予0.67g/kg、1.0g/kg、1.32g/kg。通过观察血流动力学参数和右心肥厚指数评估PAH。苏木精和伊红染色及透射电镜观察肺组织的病理特征和超微结构。免疫组织化学检测PCNA蛋白的表达。Western blot检测PCNA和细胞色素C、Caspase-3、Caspase-9的表达。实时荧光定量检测miR-130a及Gax mRNA表达。2.分离培养原代大鼠肺动脉平滑肌细胞(Pulmonary artery smooth muscle cells,PASMCs)。低氧培养PASMCs,采用不同浓度的复方薤白胶囊提取液干预细胞,分别在培养6h、12h、24h检测细胞增殖情况。采用流式细胞术检测复方薤白胶囊干预后PASMCs 细胞周期,凋亡情况。Western blot 检测 PCNA、bcl-2、caspase-3、caspase-8、caspase-9、Gax蛋白的表达。实时荧光定量检测miR-130a及Gax mRNA表达。3.明确复方薤白胶囊通过干预miR-130a靶向调节Gax,来调节PASMCs细胞增殖。采用RNA干扰技术,转染miR-130a模拟物(mimic)或miR-130a抑制剂(inhibitor)后,予复方薤白胶囊提取液干预,实时荧光定量检测miR-130a及Gax mRNA的表达,MTT法检测PASMCs细胞增殖情况,Western blot检测Gax蛋白的表达。进一步,采用双荧光素酶报告基因检测试验,验证Gax与miR-130a的靶向关系。采用RNA干扰技术,沉默Gax表达,予复方薤白胶囊提取液干预PASMCs,实时荧光定量检测Gax mRNA的表达,MTT法检测PASMCs增殖情况,Western blot检测PCNA、Gax蛋白的表达。结果:1.模型组的mPAP和RVSP值显着高于对照组(P<0.01),表明PAH模型成功建立;复方薤白胶囊治疗后,各个治疗组的mPAP、RVSP及RVHI均显着下降(P<0.01或P<0.05)。H&E染色结果显示,经过治疗后,肺血管壁增厚程度明显减轻,管腔增大,肺组织炎症、纤维增生等病变程度也相应减轻。透射电镜结果观察肺组织超微结构显示,经过治疗后,肺组织超微结构不同程度显示出平滑肌细胞增殖减少,内皮细胞减少,线粒体结构改善,胶原纤维减少等表现。免疫组化检测肺组织PCNA表达,模型组的PCNA阳性细胞百分比明显高于对照组(P<0.01),各个治疗组均有不同程度的降低。Western blot检测肺组织蛋白表达,经过治疗后PCNA的表达水平不同程度下降,而Cytochrome C,Caspase3和Caspase9的表达则不同程度上升(P<0.01或P<0.05)。实时荧光定量检测大鼠肺组织miR-130a及Gax mRNA表达,模型组的大鼠肺组织miR-130a表达显著上升(P<0.01),GaxmRNA的表达显著下降(P<0.01);经过复方薤白胶囊药物干预后,各组miR-130a表达显著下降(P<0.01或P<0.05),Gax mRNA表达显著上升(P<0.01)。2.大鼠原代肺动脉平滑肌细胞培养经过鉴定,可鉴定培养的细胞为肺动脉平滑肌细胞。缺氧24小时后,低氧培养的PASMCs增殖最为显著(P<0.01),复方薤白胶囊提取液可抑制PASMCs的增殖,抑制效果呈现出浓度依赖。流式细胞仪分析显示,低氧组细胞G1期细胞百分比下降,S期细胞百分比上升;药物干预组的G1期细胞百分比上升,S期细胞百分比下降。流式细胞仪检测凋亡水平结果显示,与正常组相比,低氧组PASMCs调亡细胞比率显著降低(P<0.01);经过复方薤白胶囊提取液干预后,低氧干预的PASMCs凋亡细胞率增加。Western blot检验PCNA、bcl-2蛋白,在低氧组的表达水平显着高于对照组,经过药物干预以后,药物干预组的PCNA及bcl-2蛋白表达水平显著下降(P<0.01);caspase3、caspase-8、caspase-9、Gax在低氧组的表达降低,经过药物干预以后,表达上升(P<0.05或P<0.01)。实时荧光定量PCR检测结果显示,低氧组PASMCs的miR-130a表达显著上升(P<0.01),Gax mRNA表达显著下降(P<0.01);经过药物干预后,miR-130a表达显著下降,Gax mRNA表达显著上升(P<0.05或P<0.01)。3.转染miR-130a mimic或miR-130a inhibitor后,实时荧光定量PCR结果显示,Gax mRNA的表达水平与miR-130a呈现相反趋势。转染miR-130a mimic,对于PASMCs增殖有促进作用;转染miR-130a inhibitor,对于PASMCs增殖起到抑制作用;低氧组PASMCs的增殖水平显著升高(P<0.01),经过复方薤白胶囊干预PASMCs后,低氧+药物组、低氧+药物+miR-130a mimicNC组、低氧+药物+miR-130a inhibitor NC组、低氧+药物+miR-130a inhibitor组的增殖水平均显著降低,其中低氧+药物+miR-130a inhibitor组最低;而低氧+药物+miR-130a mimic组增殖水平则上升。Western blot检验结果显示,与对照组相比,低氧组的Gax蛋白水平显著降低(P<0.01);复方薤白胶囊干预后,低氧+药物组、低氧+药物+mimic NC组、低氧+药物+inhibitor NC组、低氧+药物+miR-130a inhibitor组Gax蛋白表达水平均显著升高(P<0.01),并且在低氧+药物+miR-130a inhibitor组的表达水平最高;低氧+药物+miR-130amimic组表达水平显著降低(P<0.01)。双荧光素酶报告基因实验结果验证了 Gax是miR-130a的靶基因,表明二者有直接靶向作用关系。进一步通过siRNA-Gax转染细胞,予复方薤白胶囊干预后,与对照组比较,低氧组PASMCs的GaxmRNA表达水平显著降低(P<0.01);低氧+药物组、低氧+药物+siRNA NC对照组的Gax mRNA表达水平均有所升高;低氧+药物+si-Gax组表达水平则进一步降低。MTT实验结果显示,低氧组PASMCs的增殖水平显著升高(P<0.01);经过复方薤白胶囊干预后,低氧+药物组、低氧+药物+si-NC组的增殖水平显著降低;低氧+药物+si-Gax组增殖水平显著上升。Western blot结果显示,低氧组Gax蛋白表达水平显著降低(P<0.01),PCNA蛋白水平明显升高(P<0.01);复方薤白胶囊干预后,低氧+药物组、低氧+药物+si-NC组Gax表达水平显著升高,PCNA表达水平显著降低(P<0.05或P<0.01);而低氧+药物+si-Gax组的Gax的表达水平明显下降(P<0.01),PCNA表达水平显著升高(P<0.05)。结论:1.复方薤白胶囊对于PAH大鼠治疗有效,可以改善其临床症状;降低肺动脉压、右心室压,改善右心肥厚;改善肺血管重构,改善肺组织有关血管的超微结构;抑制PCNA的表达,促进细胞色素C、Caspase-3、Caspase-9的表达;降低肺组织miR-130a的表达,升高Gax mRNA的表达。2.成功分离培养大鼠原代肺动脉平滑肌细胞,复方薤白胶囊对于低氧培养的PASMCs细胞具有改善增殖、改善细胞周期、促进凋亡的作用;可以降低PCNA、bcl-2蛋白水平,提高caspase-3、caspase-8、caspase-9、Gax表达水平;可以降低miR-130a表达水平,升高Gax mRNA表达水平。3.细胞转染及双荧光素酶报告基因结果显示,Gax是miR-130a的靶基因。miR-130a可以抑制Gax mRNA的表达,miR-130a对于低氧培养的PASMCs增殖有促进作用,Gax对于低氧培养的PASMCs增殖有抑制作用。复方薤白胶囊通过干预miR-130a靶向调控Gax,发挥对于PASMCs的增殖抑制作用。4.复方薤白胶通过干预miR-130a靶向调控Gax,抑制肺动脉平滑肌细胞的增殖,达到改善肺血管重构、降低肺动脉高压的作用。