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1.猪源牛病毒性腹泻病毒分离与鉴定将处理后BVDV阳性仔猪组织样品接种MDBK细胞,分离到1株猪源BVDV命名为SD0803株。通过细胞培养、直接免疫荧光、5’-UTR与NproPCR扩增、电镜观察、TCID50测定及对其分子进化特征加以分析。结果表明,该毒株在MDBK细胞上盲传至13代未出现细胞病变。在直接免疫荧光试验中呈阳性荧光信号。PCR扩增分别获得5’-UTR与Npro预期大小DNA片段。电镜观察,病毒粒子略呈圆形,有囊膜,直径约50nm。病毒滴度为10-6.5TCIDso·0.2mL-1。 SD08035’-UTR、 Npro序列进化分析显示,该分离株属于BVDV-1,与己知BVDV-1各亚型之问同源性较低,单独成一分支。以上结果推断,成功分离鉴定一株猪源BVDV SD0803,该毒株为非致病变型BVDV-1,极有可能为BVDV-1新的亚型。2.猪源牛病毒性腹泻病毒SD0803株全长基因序列的测定及生物信息学分析采用RT-PCR方法分10个片段扩增SD0803株全基因序列；病毒5’-末端与3’-末端序列采用RACE方法扩增,扩增得到的各片段克隆测序。结果,将测序得到的个片段序列采用Seqman软件拼接后,得到了SD0803分离株全长序列,其长度为1227Int,包括5’-UTR (388nt)3’-UTR (186nt)以及一个编码3898个氨基酸的大ORF,不含外源基因序列。成功获得BVDV SD0803株全基因序列,丰富了猪源BVDV流行病学研究资源。采用MEGA4.1、 DNAStar、 I-TASSER Server、 CLC RNA Workbench等生物信息学软件对SD0803全长序列进行分析,结果表明：SD0803株全长序列与BVDV-1参考株在一簇,与ZM-95亲缘关系最近,二者同源性仅为83.2%；该毒株各基因与瘟病毒参考株同源性为42.7%-91.7%；5’-UTR存在三个高变区、两个oligopyrimidine-rich tracts,形成4个(A、B、C、D)功能区的二级结构；3’-UTR的一级结构存在一个高变区与一个相对保守区,在高变区里少了约40nt,二级结构与牛源参考株差异较大,仅形成3个茎-环结构；结构蛋白区含有14个潜在糖基化位点；I-TASSER Server预测SD0803分离RdRp高级结构,该毒株RdRp含有50.9%氨基酸形成(366/719)卷曲结构(coil,c)；8.6%(62/719)氨基酸形成β-片状折叠结构(S)；剩余的的氨基酸(40.5%,291/719)形成螺旋结构(helix, H);三级结构具有典型的核酸复制酶“手状结构”,与BVDV1S4F结构相似。本研究分析和预测了SD0803株全长序列的进化、结构与功能的关系,为进一步研究其生物学功能及其应用奠定基础。3.猪源牛病毒性腹泻病毒套式PCR检测方法的建立根据GenBank中BVDV-1、 BVDV-2、CSFV及新出现瘟病毒的基因序列,设计2对特异引物,建立了能鉴别诊断BVDVs与CSFV的Nested-PCR检测方法；确定其方法的特异性、敏感性、稳定性。建立的Nested-PCR能从BVDVs标准毒株、猪源BVDV毒株中扩增198bp特异性片段,对猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒检测结果为阴性,此结果表明,该方法具有较好特异性；其敏感性可检测到0.195fg RNA模板量；经重复性试验表明该方法具有良好稳定性。初步应用检测表明,猪BVDV阳性率较高,达36.0%；牛血清及其制品、猪瘟活疫苗BVDVs污染严重。本试验建立的Nested-PCR具有敏感、特异和稳定等特点,可用于临床诊断和流行病学调查。4.我国部分地区猪源牛病毒性腹泻病毒分子流行病学研究采用Nested-PCR方法检测了2007年至2010年问从北京、河南、新疆、山东、江西、浙江、安徽、湖南、广西、江苏和上海等地采集的猪病料,同时采用该方法对我国部分地区采集牛场的牛血清、国产商品胎牛血清、进口商品胎牛血清、猪瘟活疫苗、猪繁殖与呼吸综合征活疫苗、猪伪狂犬病活疫苗、MDBK细胞进行了检测。结果显示,猪病料中BVDV总阳性率为11.88%(146／1229),2007年至2010年感染率呈增长趋势；牛场的牛血清阳性率26.0%(130／500)；国产商品胎牛血清96.4%(53／55)；进口商品胎牛血清100%(10／10)；猪瘟活疫苗52.0%(26／50)；猪繁殖与呼吸综合征活疫苗和猪伪狂犬病活疫苗未检测出BVDV; MDBK细胞均呈阳性。应用生物信息学软件对不同来源的毒株5’-UTR序列进行遗传进化分析,结果表明,来自牛场的牛血清中,4株为BVDV-1m,2株为BVDV-1b,还有1株属于BVDV-1a;商品胎牛血清中,BVDV-1b (FS2、FS4), BVDV-1c(FS3),BVDV-1m(DFBS2/3、FS5),BVDV-1p(FS6), BVDV-2a (FS1),还有一株暂不确定型；猪活疫苗中,2株属于BVDV-1m,2株为BVDV-1o,1株为BVDV-1k,1株为BVDV-1b;在猪源BVDV分离株中,1株(BVDV-1a),6株(BVDV-1b),6株(BVDV-1m),1株(BVDV-1o)还有6株暂不能确定亚型；猪源BVDV毒株与牛血清(牛场)毒株同源性为87.3%-100%,与国产商品血清(除了FSl为BVDV-2外)为77.1%～98.8%,所有猪源BVDV毒株与进口商品血清80.5%～97.5%。猪源BVDV毒株与猪瘟活疫苗源BVDV之间,在病毒最保守区(5’-UTR)均有变异,这两种不同来源毒株之间核苷酸的变异无规律性。5.猪源牛病毒性腹泻病毒荧光定量PCR检测方法的建立根据BVDVs与CSFV5’-UTR保守序列,设计一套引物和特异TaqMan探针,以本实验室构建的猪源BVDV5’-UTR阳性重组质粒为标准品,通过优化反应条件,建立了标准曲线。以构建的标准品为模板进行了特异性、敏感性、重复性试验、并应用于临床检测,结果,该方法检测CSFV、 PRRSV均为阴性；最低可检测到每个反应相当于10拷贝的标准品DNA;重复性试验的批内变异系数为0.20%-0.95%；应用所建立方法对临床样品进行检测,其结果与普通RT-PCR结果的符合率为86.7%。本研究建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、重复性好等优点,可用于猪感染BVDV、猪瘟疫苗污染BVDVs的监测。6.猪源牛病毒性腹泻病毒E2蛋白表达及抗体制备表达去除猪源牛病毒性腹泻病母(BVDV) SD0803株E2基因跨膜疏水区(sE2)的蛋白并制备其抗体,RT-PCR扩增SD0803株sE2基因,构建重组原核表达载体pGEX-4T-1-sE2(rsE2),转化大肠埃希菌BL21(DE3), IPTG诱导蛋白表达,将纯化的重组蛋白为抗原免疫家兔制备多克隆抗体。采用间接ELISA、 Western-blot、间接免疫荧光等方法鉴定获得的抗体。结果显示,抗体效价最高可达1：256000；制备的抗体可与rsE2蛋白特异性结合；该抗体可特异性识别BVDV感染MDBK细胞表达的E2蛋白,显示抗体高度的特异性。