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霍山石斛(Dendrobium huoshanense C. Z.Tang et S.J.Chen)是兰科石斛属多年生草本植物，主要分布于我国大别山及邻近地区,具有极高的观赏和药用价值，由于霍山石斛在自然状态下繁殖率低，加之人们过度采挖，目前，霍山石斛野生资源濒临灭绝。市场中霍山石斛存在种质资源混乱，质量参差不齐等情况，随着人们对道地药材的重视，药用植物霍山石斛的保护和鉴定越发受到关注，本研究通过霍山石斛转录组测序开发EST-SSR引物，基于EST-SSR多态引物研究霍山石斛栽培居群及野生居群的遗传多样性及遗传结构，并为霍山石斛的保护和遗传改良提供科学依据，本研究基于核基因ITS和叶绿体基因matK，psbK-psbI序列构建霍山石斛,铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)，铜皮石斛(Dendrobium moniliforme (L.)Sw.)，河南石斛(DendrobiumhenanenseJ.L.LiuetL.X.Gao)的系统发育关系，检验不同的DNA条形码及其片段组合在4个石斛种中的鉴定能力。主要研究内容及结果如下：
1.转录组测序及EST-SSR引物开发
霍山石斛转录组深度测序后最终得到58202个Unigene，总长度为54,769,077bp，平均长度为941bp，N50含量为1628bp，GC含量为42.47%，检测出1-6个碱基重复的SSR序列7781个，其中二碱基重复的SSR最为丰富(3119，40.08%)，其次是单碱基重复(2558，32.87%)，再者为三碱基重复(1817，23.35%)，最丰富的二碱基重复单元为AG/CT(2666，54.01%)，三碱基重复单元为AAG/CTT(573，11.61%)。利用3个种群的182个个体对筛选出的10对扩增稳定且多态性较高的引物进行进一步多态性验证。共检测到75个等位基因，每个位点等位基因数4～11个，平均等位基因数7.5个，多态性位点观测杂合度(Ho)范围是0.121～0.830，平均观测杂合度为0.574，期望杂合度(He)在0.267～0.820之间，平均期望杂合度为0.646，多态信息含量(PIC)范围是0.253～0.794，平均多态信息含量为0.607。这10对引物表现出较高的多态性水平，可用于后续的霍山石斛居群的遗传多样性与遗传结构研究。
2.基于EST-SSR的霍山石斛居群遗传多样性与遗传结构特征
利用10对EST-SSR引物对13个霍山石斛居群，1个铜皮石斛居群和1个铁皮石斛居群进行群体遗传学研究。结果表明15个居群的平均等位基因数在2.600～4.800之间，有效等位基因数范围是1.811～3.337，平均观察杂合度为0.578，平均期望杂合度是0.548，其中霍山石斛平均遗传多样性水平较高(Ho=0.591，He=0.557)本研究中霍山石斛居群KS(Ho=0.640，He=0.603)，HSD(Ho=0.646，He=0.595)，JXZ(Ho=0.625，He=0.626)拥有丰富的遗传多样性，且居群内拥有更多的私有等位基因，可用于霍山石斛的遗传改良。
基于10对EST-SSR引物构建的STRUCTURE和NJ树分析结果表明，采自太平畈乡不同地点的5个居群(WJD，DJL，GSC，KS，TZ)聚类在一起，此分支中包括3个野生居群，其余8个霍山石斛居群(PR，FK，JZ，HSD，JXZ ，SKJ，YK， PYT)聚类在一起，铁皮石斛和铜皮石斛单独聚类为一支，对霍山石斛13个居群进行AMOVA分析，结果显示居群间存在中等程度的遗传分化(FST=0.10069)，遗传变异主要存在于群体内个体间。本研究中霍山石斛栽培居群也呈现出遗传多态性较高的现象，可能是由于栽培霍山石斛种源来源于霍山石斛野生资源，在实际的霍山石斛组织培养过程中时，种子来源较为复杂多样，不同种源的霍山石斛种子进行培养，且霍山石斛进行组织培养时进行了多次继代培养，继代培养次数较高时物种内存在一定的变异，因此栽培居群的遗传多样性呈现出较高的趋势。
3.基于DNA条形码对霍山石斛种间的分子鉴别研究
利用DNA条形码ITS、matK、psbK-psbI对霍山石斛，铁皮石斛，铜皮石斛，河南石斛4个种群39个个体进行分子鉴别的研究，三个DNA条形码扩增成功率ITS＞matK＞psbK-psbI，测序成功率ITS＞psbK-psbI＞matK，种间遗传距离均高于种内遗传距离，平均种间遗传距离ITS＞psbK-psbI＞matK，变异率ITS＞matK＞psbK-psbI。三个DNA条形码引物中ITS和psbK-psbI有较高的鉴定成功率，ITS构建的NJ树分支支持率(99%)较psbK-psbI更高(64%)，组合片段ITS+psbK-psbI的鉴定效果与ITS的鉴定效果相同，ITS+matK+psbK-psbI未表现出更好的鉴定效果。考虑到鉴定的成本及鉴定效率，认为ITS最适合作为霍山石斛的标准条形码对霍山石斛进行鉴定，ITS序列也有望作为石斛属的标准条形码候选序列进行研究，此外，在后续对石斛属的鉴定研究中，psbK-psbI也可考虑作为候选条形码。通过单片段ITS，matK，psbA-psbI以及组合片段ITS+psbK-psbI，ITS+matK+psbK-psbI对4个石斛种进行研究，结果表明霍山石斛与铜皮石斛亲缘关系最近，其次为河南石斛，霍山石斛与铁皮石斛亲缘关系最远。
4.基于DNA条形码对霍山石斛种内分子鉴定研究
通过单片段ITS，matK，psbA-psbI以及组合片段ITS+matK+psbK-psbI对霍山石斛野生资源(6个)及栽培资源(14个)共20个个体进行研究，结果表明霍山石斛栽培居群与野生居群未出现明显的分化，通过DNA条形码无法对霍山石斛栽培资源和野生资源不同居群进行区分，可能是因为霍山石斛的栽培历史较短，进行栽培的种子，无菌苗或愈伤组织均来源于野生居群，因此霍山石斛栽培居群与野生居群未出现明显分化。
1.转录组测序及EST-SSR引物开发
霍山石斛转录组深度测序后最终得到58202个Unigene，总长度为54,769,077bp，平均长度为941bp，N50含量为1628bp，GC含量为42.47%，检测出1-6个碱基重复的SSR序列7781个，其中二碱基重复的SSR最为丰富(3119，40.08%)，其次是单碱基重复(2558，32.87%)，再者为三碱基重复(1817，23.35%)，最丰富的二碱基重复单元为AG/CT(2666，54.01%)，三碱基重复单元为AAG/CTT(573，11.61%)。利用3个种群的182个个体对筛选出的10对扩增稳定且多态性较高的引物进行进一步多态性验证。共检测到75个等位基因，每个位点等位基因数4～11个，平均等位基因数7.5个，多态性位点观测杂合度(Ho)范围是0.121～0.830，平均观测杂合度为0.574，期望杂合度(He)在0.267～0.820之间，平均期望杂合度为0.646，多态信息含量(PIC)范围是0.253～0.794，平均多态信息含量为0.607。这10对引物表现出较高的多态性水平，可用于后续的霍山石斛居群的遗传多样性与遗传结构研究。
2.基于EST-SSR的霍山石斛居群遗传多样性与遗传结构特征
利用10对EST-SSR引物对13个霍山石斛居群，1个铜皮石斛居群和1个铁皮石斛居群进行群体遗传学研究。结果表明15个居群的平均等位基因数在2.600～4.800之间，有效等位基因数范围是1.811～3.337，平均观察杂合度为0.578，平均期望杂合度是0.548，其中霍山石斛平均遗传多样性水平较高(Ho=0.591，He=0.557)本研究中霍山石斛居群KS(Ho=0.640，He=0.603)，HSD(Ho=0.646，He=0.595)，JXZ(Ho=0.625，He=0.626)拥有丰富的遗传多样性，且居群内拥有更多的私有等位基因，可用于霍山石斛的遗传改良。
基于10对EST-SSR引物构建的STRUCTURE和NJ树分析结果表明，采自太平畈乡不同地点的5个居群(WJD，DJL，GSC，KS，TZ)聚类在一起，此分支中包括3个野生居群，其余8个霍山石斛居群(PR，FK，JZ，HSD，JXZ ，SKJ，YK， PYT)聚类在一起，铁皮石斛和铜皮石斛单独聚类为一支，对霍山石斛13个居群进行AMOVA分析，结果显示居群间存在中等程度的遗传分化(FST=0.10069)，遗传变异主要存在于群体内个体间。本研究中霍山石斛栽培居群也呈现出遗传多态性较高的现象，可能是由于栽培霍山石斛种源来源于霍山石斛野生资源，在实际的霍山石斛组织培养过程中时，种子来源较为复杂多样，不同种源的霍山石斛种子进行培养，且霍山石斛进行组织培养时进行了多次继代培养，继代培养次数较高时物种内存在一定的变异，因此栽培居群的遗传多样性呈现出较高的趋势。
3.基于DNA条形码对霍山石斛种间的分子鉴别研究
利用DNA条形码ITS、matK、psbK-psbI对霍山石斛，铁皮石斛，铜皮石斛，河南石斛4个种群39个个体进行分子鉴别的研究，三个DNA条形码扩增成功率ITS＞matK＞psbK-psbI，测序成功率ITS＞psbK-psbI＞matK，种间遗传距离均高于种内遗传距离，平均种间遗传距离ITS＞psbK-psbI＞matK，变异率ITS＞matK＞psbK-psbI。三个DNA条形码引物中ITS和psbK-psbI有较高的鉴定成功率，ITS构建的NJ树分支支持率(99%)较psbK-psbI更高(64%)，组合片段ITS+psbK-psbI的鉴定效果与ITS的鉴定效果相同，ITS+matK+psbK-psbI未表现出更好的鉴定效果。考虑到鉴定的成本及鉴定效率，认为ITS最适合作为霍山石斛的标准条形码对霍山石斛进行鉴定，ITS序列也有望作为石斛属的标准条形码候选序列进行研究，此外，在后续对石斛属的鉴定研究中，psbK-psbI也可考虑作为候选条形码。通过单片段ITS，matK，psbA-psbI以及组合片段ITS+psbK-psbI，ITS+matK+psbK-psbI对4个石斛种进行研究，结果表明霍山石斛与铜皮石斛亲缘关系最近，其次为河南石斛，霍山石斛与铁皮石斛亲缘关系最远。
4.基于DNA条形码对霍山石斛种内分子鉴定研究
通过单片段ITS，matK，psbA-psbI以及组合片段ITS+matK+psbK-psbI对霍山石斛野生资源(6个)及栽培资源(14个)共20个个体进行研究，结果表明霍山石斛栽培居群与野生居群未出现明显的分化，通过DNA条形码无法对霍山石斛栽培资源和野生资源不同居群进行区分，可能是因为霍山石斛的栽培历史较短，进行栽培的种子，无菌苗或愈伤组织均来源于野生居群，因此霍山石斛栽培居群与野生居群未出现明显分化。