论文部分内容阅读
象草[Pennisetum purpureum Schum.]系禾本科(Gramineae)狼尾草属多年生C4草本植物。由于它具有产量高、再生能力强、营养丰富、适口性良好、抗逆性强等优点，使之成为了热带、亚热带地区重要的资源植物。象草无论是作为能源植物，还是饲用植物及造纸原料，其品质与低木质素含量密切相关。RNAi(RNA interference)是指一些与靶基因序列同源的小片段干扰RNA高效和特异性地使mRNA降解，从而导致内源靶基因的沉默，最终产生相应功能的表型缺失现象。它是一种转录后的基因沉默(post-transcriptional gene silencing)技术，目前已被广泛应用于植物基因功能的研究。
4-香豆酸：CoA连接酶(4-coumarate: CoA ligase，4CL)是木质素合成中的一个关键酶之一，对羟基肉桂酸形成硫酯这一必要的活化过程进行调控。为今后探讨象草4-香豆酸：CoA连接酶(4CL)基因下调表达对木质素合成的影响，本文以华南象草(P.purpureum cv. Huanan)为实验材料，初步探讨了华南象草离体培养各个阶段的最佳条件，并构建了4CL酶基因的RNAi表达载体，主要研究结果如下：
1.以本课题组从摩特矮象草中分离的4CL基因序列(登录号：GU997597)，并与象草亲缘关系比较近的4种植物[玉米(Zea mays)、柳枝稷(Panicum virgatum)、多年生黑麦草(Lolium perenne)、水稻(Oryza sativa ssp. japonica)]的4CL序列作比对分析，选用同源性较高部分，设计特异性引物，克隆出一段长为374bp片段。随后将目的片段测序，将测序结果在NCBI-BLASTN上进行同源性比较。经分析，所克隆的片段为4CL基因的片段，因此可以用来干扰载体的构建。
2.通过TOPO克隆，将4CL目的基因片段连接到载体pCR(?)/GW/TOPO(?)上，从而构建了入门克隆载体pENTR-4CL;再经过LR反应使pENTR-4CL上的干扰片段进入目的载体pCB2004B上，形成表达载体pCB2004B-4CL，最后通过冻融法将其转入到根癌农杆菌EHA105中。菌液PCR结果表明RNAi载体质粒已成功转入农杆菌中。
3.以象草心叶为外植体，对不同消毒方法进行了比较。结果表明，最佳消毒程序为：剥除茎梢的外叶鞘，直至倒数第二个可见节；随后用75％酒精擦洗叶鞘外部及两端切口；在无菌环境下，用75%的酒精浸泡30s，然后再用0.1%HgCl2浸泡6min，最后用无菌水洗8～10次。
4.在象草再生体系中，以心叶为外植体，其愈伤组织的诱导和继代采用相同培养基，即MS+2，4-D0.5mg/L+6-BA0.5mg/L+NAA1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉8.0g/L。象草胚性愈伤组织的分化，以MS+NAA0.5mg/L+6-BA2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉8.0g/L+5%椰乳条件效果最好。生根培养，以1/2MS为基本培养基，不加任何激素，无菌苗生根情况最好；在移栽过程中，华南象草无菌苗易成活，成活率可达100%。