【摘 要】
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小脑具有控制、协调和改善机体的运动及平衡等功能,此外,近期有研究表明小脑功能异常与孤独症谱系障碍等精神疾病有一定关系。因此,研究小脑发育的分子机制对深入探索小脑的功能及相关疾病的致病机理具有重要意义。小脑皮层含有颗粒细胞、胶质细胞和浦肯野细胞等神经元,其中颗粒细胞在小脑中含量最多,对小脑发育及形态形成具有重要意义。在脑组织中,mTOR信号通路介导调节神经元的形成及脑皮质层发育等。mTORC1被Ts
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小脑具有控制、协调和改善机体的运动及平衡等功能,此外,近期有研究表明小脑功能异常与孤独症谱系障碍等精神疾病有一定关系。因此,研究小脑发育的分子机制对深入探索小脑的功能及相关疾病的致病机理具有重要意义。小脑皮层含有颗粒细胞、胶质细胞和浦肯野细胞等神经元,其中颗粒细胞在小脑中含量最多,对小脑发育及形态形成具有重要意义。在脑组织中,mTOR信号通路介导调节神经元的形成及脑皮质层发育等。mTORC1被Tsc1/2复合物抑制,而作为mTOR结合蛋白的Raptor在一定程度上具有调控mTORC1活性的作用。本课题组前期工作中利用Cre-LoxP系统和Atoh1-Cre小鼠制作了Tsc1-/-及Raptor-/-条件性敲除小鼠,研究发现Tsc1敲除后mTORC1信号通路的激活或Raptor敲除后mTORC1的失活与小鼠听力的维持和老年性耳聋的发生密切相关。研究表明Atoh1-Cre在内耳和小脑颗粒细胞中均有表达,但是对Tsc1及Raptor基因在小鼠小脑颗粒细胞发育中的功能仍不清楚。基于以上分析,本课题研究目的在于探索Tsc1和Raptor基因是否与小脑颗粒细胞发育有关,并初步探讨mTORC1信号通路的两种调节因子Tsc1和Raptor在小脑颗粒细胞发育中的作用。我们分别对Tsc1-/-及Raptor-/-敲除小鼠进行了步态测试、悬挂测试和转棒式疲劳仪测试等行为学测试,Tsc1-/-小鼠及Raptor-/-小鼠分别与野生鼠相比,我们观察到二者同样出现步宽较长而步长较短、悬挂维持时间明显缩短及在转棒式疲劳仪停留时间较短的情况。据此我们得出Tsc1-/-及Raptor-/-敲除小鼠小脑对身体平衡的控制作用出现异常的结论。那么Tsc1-/-及Raptor-/-小鼠的行为学表现异常是否与小脑发育出现异常有关?于是,接下来我们对Tsc1-/-及Raptor-/-小鼠分别进行小脑的组织形态学分析。与野生鼠相比,Tsc1-/-成年敲除小鼠小脑体积增大,脑叶肥厚,石蜡切片及H＆E染色显示,内颗粒细胞层细胞数目稀疏。在P5时期,Tsc1-/-小鼠小脑已经观察到异常表型。而与对照鼠相比,Raptor-/-成年敲除小鼠小脑蚓体形态变窄,两个小脑半球明显缩小,切片及H＆E染色结果显示,Raptor-/-小鼠的小脑脑叶数量明显变少,并且内颗粒细胞层的细胞密度显著变小。P6时期,Raptor-/-小鼠小脑已经出现异常。据此我们得出Tsc1-/-及Raptor-/-敲除小鼠小脑颗粒细胞的发育出现异常的结论。随后,我们利用NeuN、Ki67、Caspase-3等抗体进行了切片免疫荧光染色。结果表明,Tsc1-/-小鼠与野生型小鼠相比颗粒细胞的细胞密度减少,并且Tsc1-/-小鼠颗粒细胞祖细胞增殖受阻,成年期Tsc1-/-小鼠颗粒细胞凋亡比对照组增多,进而可以解释Tsc1-/-小鼠颗粒细胞密度变小及增殖异常的现象。Raptor-/-小鼠颗粒细胞的细胞密度降低,颗粒细胞出现增殖异常,并且成年期Raptor-/-小鼠颗粒细胞凋亡增多。Raptor-/-小鼠从幼年期至成年期浦肯野细胞均出现多层聚集的情况,同时Raptor-/-小鼠贝格曼胶质细胞长度变短及排布杂乱。据此可以推测Raptor-/-小鼠颗粒细胞密度变小及增殖延迟现象出现的原因。通过Western Blot,我们发现Tsc1-/-小鼠颗粒细胞中细胞自噬水平较低,同时Tsc1对mTORC1的抑制作用缺失,使其发生激活,从而导致下游的S6K1及S6磷酸化水平升高。而Raptor-/-小鼠颗粒细胞中细胞自噬水平升高,同时Raptor对mTORC1的调节作用缺失,使下游的S6K1及S6磷酸化水平降低。以上结果表明mTORC1信号通路的两种调节因子Tsc1和Raptor在小脑颗粒细胞发育中发挥着重要功能,Tsc1敲除后mTORC1活性升高以及Raptor敲除后mTORC1活性降低均引起小脑颗粒细胞发育异常。因此mTORC1活性需在一定平衡状态下,才能使小脑颗粒细胞发育维持正常水平。本论文得到了Tsc1及Raptor基因在小脑颗粒细胞中被条件性敲除的小鼠模型,并探讨了 TSc1及Raptor基因在小脑颗粒细胞发育中的功能,可以为小脑相关疾病的临床诊断、预防与治疗提供一定的科学依据。
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