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维生素C是一种人类必须从外界获取的营养物质。2-酮基-L-古龙酸（2-keto-L-gulonic acid,2-KLG）是维生素C的直接前体,通过三菌两步发酵法获得。在这个过程中,D-山梨醇通过D-山梨醇脱氢酶（SLDH）、L-山梨糖脱氢酶（SDH）和L-山梨酮脱氢酶（SNDH）最终转化为2-KLG。理论上将三种酶在合适的菌株中进行共表达,便可以构建具有更低生产成本、更稳定发酵工艺、更加绿色环保的一菌一步发酵方法。当前通过代谢工程构建一步发酵产2-KLG菌株的研究较多,但2-KLG的产量还不能满足和取代现有的三菌两步发酵工艺。随着酶工程的蓬勃发展,解析酶的催化机制、提升酶的催化活性成为一种可行的策略,有利于进一步提升2-KLG的产量。在2-KLG合成过程中,L-山梨糖到2-KLG的转化被认为是限速步骤。其中涉及到SNDH和SDH。本研究选取氧化葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter oxydans）WSH-004中SNDH和SDH作为研究对象,通过酶学性质的研究,详细地了解了关键酶的理化性质;通过晶体结构的解析、蛋白结构模拟和相应的体外验证,提出了关键酶的动态调控机制和分子催化机制;通过半理性设计,有效地提升了关键酶的比酶活,并初步提升了2-KLG的产量;最后基于对重组菌株的发酵优化,2-KLG产量达到5.03 g/L,L-山梨糖转化率为50%。此外,还鉴定了在大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）中和L-山梨糖转运相关的磷酸转运酶系统（PTS）。研究工作为最终构建一步发酵生产2-KLG的菌株提供了有效的酶信息、优良的酶元件,对维生素C工业化生产方法的革新具有重要地参考意义。具体研究结果如下:（1）SNDH的酶学性质表征。针对缺乏对G.oxydans WSH-004中SNDH酶学性质表征地状况,首先将SNDH在E.coli中进行了异源表达并利用两步纯化法进行了纯化。其次对SNDH进行了酶学性质表征。研究显示,SNDH可以利用NADP+和NAD+作为辅因子,当使用L-山梨酮作为底物时,NADP+和NAD+的Km分别为0.14 m M和0.42m M。当使用NADP+和NAD+作为辅因子时,L-山梨酮的Km分别为0.21 m M和0.53 m M。SNDH具有较强的底物专一性,最适底物为L-山梨酮,最适p H约为10.5,最适反应温度约为50℃,在30℃下有较好的热稳定性,Mg2+可以促进SNDH酶活。（2）SNDH的晶体结构、动态调控机制和催化机制解析。针对G.oxydans WSH-004中SNDH的催化机制不明确的问题,首先通过结构解析,分别获得了底物口袋关闭的氧化态SNDH、底物口袋开放的还原态SNDH和失活型SNDH（突变体C296A）三种不同形态的晶体结构,并保存至蛋白质数据库（PDB）中,编号分别为7W5L、7W5N和7W5K。其次通过分析晶体结构,发现在SNDH中残基Cys295和催化残基Cys296之间具有可逆二硫键。它允许SNDH在氧化态和还原态之间切换,从而打开或关闭底物口袋。最终,结合体外生化和定点诱变研究,分别提出了SNDH基于相邻半胱氨酸氧化还原的动态调控机制和催化机制。（3）半理性设计改造SNDH。为了进一步提升SNDH活性,利用半理性设计对2-KLG生产途径中关键酶SNDH进行了改造。首先基于SNDH的结构和调控机制,利用i)消除氧化态SNDH、ii)减小底物口袋入口处位阻、iii)增强质子传递和iv)优化底物口袋内氨基酸四种策略对SNDH进行改造。最终获得5个比酶活提升的突变体,分别是M167L、S453A、L460V、E471D和M167L/S453A/E471D,其中突变体M167L比酶活提升最高,是野生型的2.7倍。随后基于分子动力学模拟解释了突变体比酶活提升的机制。（4）半理性设计改造SDH。针对L-山梨糖转化率较低的问题,对2-KLG生产途径中的另一个关键酶SDH进行了半理性设计。首先建立了基于产量关联的SDH突变体的筛选方法。随后通过i)Ala扫描、ii)迭代饱和突变、iii)表面电荷优化三种策略,获得了5个有助于提升2-KLG产量的SDH突变体。其中包含突变体V336I/V368A的菌株在24孔板中可产2-KLG 3.39 g/L,是野生型的1.9倍,L-山梨糖转化率为34%。（5）发酵优化提升2-KLG产量与L-山梨糖的消耗相关基因的鉴定。针对高效酶元件的利用和如何进一步提升2-KLG转化率的问题,首先对RS-M167L-V336I/V368A进行了发酵优化,重组菌株在摇瓶中发酵16 h,2-KLG达到最高:5.03 g/L,转化率达到50%。其次,通过基因组信息比较,在E.coli BL21（DE3）中找到了4个拟与L-山梨糖代谢相关的候选基因,通过i)阻断L-山梨糖磷酸化和ii)敲除拟L-山梨糖磷酸转运系统两种策略对E.coli BL21（DE3）进行了基因改造,并构建重组菌株并进行发酵验证。最终确定基因aga V(EⅡBsor)、aga W(EⅡCsor)、aga E(EⅡDsor)和aga F(EⅡAsor)和L-山梨糖的转运相关,但没能进一步提升2-KLG的产量,且改造后的重组菌株还可以消耗L-山梨糖,说明在E.coli BL21（DE3）还有其它L-山梨糖利用系统待发掘。