论文部分内容阅读
糖尿病足(diabetic foot,DF)是最严重的糖尿病并发症之一,致残致死率极高,且花费巨大。糖尿病患者下肢截肢多是由足溃疡导致的,外周动脉疾病(peripheral arterial disease,PAD)是影响糖尿病足溃疡最重要的因素,也是唯一独立的影响截肢预后的因素。糖尿病高糖环境下血管内皮细胞功能受损是PAD的主要发病机制。目前针对血管内皮细胞的研究很多,但很少有研究关注骨骼肌与血管新生的关系。骨骼肌是主要的糖代谢器官,同时又是血管内皮细胞生长的外环境,骨骼肌纤维存在两种类型,无氧呼吸型(糖化型)、有氧呼吸型(氧化型),两者可相互转化。研究表明,氧化肌纤维的代谢水平较高,摄糖能力更强。我们推测骨骼肌纤维类型的转变将有助于改善糖尿病环境下血管内皮细胞生长的微环境,增强血管内皮细胞的活性,促进下肢的血管新生。我们发现,运动可使VEGF增多,VEGF可显著增加小鼠毛细血管密度,且骨骼肌纤维也从无氧型变为有氧型。本课题旨在通过VEGF研究是否可通过调控肌纤维类型的转变,增多氧化肌纤维的含量,提高骨骼肌的摄糖能力,改善糖尿病下周围血管内皮细胞的微环境,增强血管内皮细胞的功能,促进下肢血管新生,改善糖尿病下肢缺血,为今后临床应用基因治疗奠定理论和实验基础,解决糖尿病足患者制动情况下糖代谢障碍及下肢缺血的难题。第一部分自主运动情况下,小鼠骨骼肌纤维类型和毛细血管密度的变化目的:明确在自主运动后,小鼠骨骼肌VEGF表达的变化,毛细血管密度的改变,骨骼肌纤维类型的转变和氧化代谢的变化。方法:将C57BL/6小鼠分为运动组和安静组,安静组置于普通笼中,运动组置于装备自主跑轮计数系统的笼中,分别在1w,2w,4w取骨骼肌组织,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测VEGF水平,测定柠檬酸合酶的活性表示氧化代谢水平,免疫荧光方法检测毛细血管密度(CD31)和骨骼肌纤维类型(MHCs)。结果:1运动后,小鼠骨骼肌组织中VEGF表达增加相比安静组(205.962±9.712 pg/ml),运动1w组,运动2w组,运动4w组VEGF含量(449.164±15.280,556.818±22.659,549.366±14.410pg/ml)明显增多(P<0.05)。2运动后,骨骼肌纤维类型和毛细血管密度的变化共聚焦荧光显微镜下可观察到,相比安静组,运动组小鼠骨骼肌氧化肌纤维(红色,MHCIIa)比例增加,毛细血管密度(绿色,CD31)增加。3骨骼肌柠檬酸合成酶活性的变化用试剂盒测定安静组和运动组骨骼肌柠檬酸合成酶活性,相比安静组(0.023±0.002μmol/min/ml),运动1w组,运动2w组,运动4w组骨骼肌柠檬酸合成酶活性(0.029±0.002,0.036±0.001,0.034±0.001μmol/min/ml),明显升高(P<0.05)。第二部分建立糖尿病小鼠下肢缺血模型,明确VEGF对骨骼肌类型转变和血管新生的作用目的:明确VEGF对糖尿病情况下骨骼肌纤维类型的转化具有直接的调控作用,并能改善糖尿病下肢缺血小鼠的下肢血流灌注。方法:C57BL/6小鼠予以高脂喂养6周末禁食12h后,腹腔注射100mg/kg STZ,造模成功后行左侧下肢股动脉结扎,制作糖尿病小鼠下肢缺血模型,腓肠肌分别注射Ad-GFP或Ad-VEGF-GFP,荧光显微镜下观察腺病毒的转染效率,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测VEGF水平,测定柠檬酸合酶的活性表示氧化代谢水平,免疫荧光方法检测骨骼肌纤维类型(MHCs),激光多普勒监测双下肢血流灌注。结果:1荧光显微镜下通过腺病毒的GFP标记观察VEGF的转染效率Ad-VEGF-GFP和Ad-GFP转染效率高,且持续到2周。2 ELISA方法检测骨骼肌VEGF表达的变化腺病毒注射后2周,Ad-VEGF-GFP转染组VEGF表达(653.373±55.348 pg/ml)明显高于Ad-GFP对照组(180.339±15.000 pg/ml)(P<0.05)。3 VEGF使糖尿病小鼠缺血下肢氧化肌纤维增多腺病毒肌注后14天,荧光显微镜下观察到Ad-VEGF-GFP组小鼠骨骼肌氧化肌纤维(红色,MHCIIa)比例增加。4骨骼肌柠檬酸合成酶活性的变化术后14天,相比空载组(0.018±0.002μmol/min/ml),VEGF组(0.030±0.003μmol/min/ml)骨骼肌柠檬酸合成酶活性明显升高(P<0.05)。5激光多普勒监测双下肢血流灌注Ad-VEGF-GFP转染组血流灌注恢复水平显著高于Ad-GFP空载组(P<0.05),提示VEGF基因转染有促糖尿病下肢血管新生的作用。第三部分通过VEGF上调氧化肌纤维,并观察肌纤维类型转换后对血管内皮细胞活性的作用及机制。目的:明确VEGF可通过调节骨骼肌类型的转变促进血管新生,并探讨其机制。方法:培养小鼠成肌细胞(C2C12)并诱导分化成肌小管并通过半定量PCR验证肌小管上VEGF受体的表达,然后加入不同浓度(5,10,20ng/ml)的重组VEGF细胞因子(rh VEGF)刺激肌小管,用PBS+BSA作为阴性对照,在不同时间(6h,12h,24h)提取细胞RNA,用实时定量PCR方法确定氧化肌纤维MHCIIa(Myhc 2a)表达量最高的VEGF浓度和时间。通过Transwell小室将氧化肌纤维表达量最高时的肌小管与脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)共培养,观察HUVEC活性的变化。葡萄糖氧化酶法测定肌小管转换为氧化肌纤维前后,葡萄糖消耗量的变化。Western检测肌小管转换为氧化肌纤维前后PGC-1α,GLUT4和COXIV表达的变化。结果:1肌小管VEGF受体的表达半定量PCR方法可检测到C2C12肌小管上有VEGFR1和VEGFR2m RNA的表达。2 VEGF促进骨骼肌类型转变rh VEGF处理后,Myhc 2a逐渐升高,在VEGF浓度为20ng/ml,干预12h时,表达量最高(P<0.0001),随着时间的延长,表达量下降。免疫荧光检测氧化肌纤维(MHCIIa,红色)的表达,可见VEGF干预组氧化肌纤维比对照组明显增多。3 HUVEC活性的变化A组(空白对照组)单纯HUVEC迁移和管状形成能力作为对照,B组(正常肌小管对照组)C2C12肌小管与HUVEC共培养后,HUVEC迁移和管状形成能力无显著变化,可见正常的肌小管对HUVEC并无明显作用。D组C2C12肌小管给予20ng/ml VEGF干预12h,即氧化肌纤维比例最高的时候与HUVEC共培养,可见HUVEC迁移和管状形成能力明显增强,比C组(VEGF对照组)20ng/ml VEGF干预12h的HUVEC迁移和管状形成能力也增强,可见是氧化肌纤维促进了HUVEC的迁移和管状形成能力。24h时各组差异最明显。4葡萄糖消耗量与空白组(0.829±0.150mmol/L)相比,VEGF组(2.126±0.220mmol/L)肌小管葡萄糖消耗量明显增加(P<0.05),但小于阳性对照胰岛素组(2.918±0.182 mmol/L)。5肌小管中PGC-1α,GLUT4和COXIV的表达情况肌小管加入20ng/ml VEGF,PBS+BSA作为阴性对照,干预12h后,氧化肌纤维增多,PGC-1α,GLUT4和COXIV表达显著增加。结论:1小鼠自主运动可以引起骨骼肌VEGF蛋白表达增加,氧化肌纤维增多,毛细血管密度增加,氧化代谢能力增强。2 VEGF可以增加糖尿病下肢缺血小鼠骨骼肌氧化肌纤维含量,增强氧化代谢水平,改善下肢血流灌注。3 VEGF可通过上调PGC-1α增加骨骼肌氧化肌纤维含量,增强线粒体生物合成,提高骨骼肌的摄糖能力,改善血管内皮细胞的微环境,增强血管内皮细胞的活性。4通过VEGF介导的骨骼肌类型转变可增强血管内皮细胞活性,促进血管新生,改善糖尿病下肢缺血,为今后临床应用基因治疗奠定了理论和实验基础,为解决糖尿病足患者制动情况下糖代谢障碍及下肢缺血的难题提供了新的思路。