论文部分内容阅读
目的:HPV16 E6/E7蛋白是主要的致癌基因并且只有长期持续感染才可能导致肺癌。癌细胞利用Warburg效应消耗更多的葡萄糖,通过有氧糖酵解获得能量,活化的GLUT1是该过程中的主要葡萄糖转运蛋白。我们以前的研究表明,HPV16 E6/E7蛋白上调了肺癌细胞中GLUT1的表达。然而,该过程中E6和E7蛋白是否能促进GLUT1的葡萄糖摄取及其分子机制尚不清楚。机制研究表明,细胞内GLUT1的过表达不是GLUT1活化的关键点。通过刺激增加GLUT1从细胞质向细胞膜的转运,或刺激已经存在于细胞膜上的GLUT1转运蛋白的活性来激活GLUT1。因此GLUT1易位至细胞膜,并且该过程中涉及的潜在分子机制是当前研究的主要目的。作为一种抑癌基因,miR-451在许多癌细胞中异常表达,它在癌症的发展和转移中起着重要的作用。研究表明,miR-451通过下调磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/AKT信号通路来抑制癌细胞的生长,直接抑制其靶基因钙结合蛋白39（CAB39）;Gou等人证明,miR-451通过靶向胶质瘤细胞中的CAB39负调控GLUT1。因此,研究HPV16 E6/E7,miR-451,CAB39和GLUT1之间的关系以及CAB39是否促使GLUT1易位至质膜并吸收了葡萄糖是我们当前研究HPV相关性肺癌中的主要目标,同时为寻找促进肿瘤进展的基因及其调控关系,治疗HPV相关性肺癌提供了新的途径并且可为肿瘤研究相关领域等方面提供新的研究方向。研究方法:我们首先应用双向转染技术调控肺癌细胞中HPV16 E6和E7的表达,应用蛋白免疫印迹（Western blotting）和实时定量聚合酶链反应（q RT-PCR）实验分别检测CAB39和GLUT1蛋白和m RNA的表达水平,PI3Kp85、P-AKT和AKT蛋白的表达水平,miR451m RNA的表达水平;然后采用转染模拟物与抑制物技术调控肺癌细胞中miR451的m RNA表达,应用蛋白免疫印迹（Western blotting）和实时定量聚合酶链反应（q RT-PCR）实验分别检测CAB39和GLUT1蛋白和m RNA的表达水平,PI3Kp85、P-AKT和AKT蛋白的表达水平;采用双向转染技术调控肺癌细胞中CAB39的表达,应用蛋白免疫印迹（Western blotting）和实时定量聚合酶链反应（q RT-PCR）实验分别检测了GLUT1蛋白和m RNA的表达水平,PI3Kp85、P-AKT和AKT蛋白的表达水平;采用转染技术调控肺癌细胞中CAB39的表达,分别采用免疫荧光实验技术和葡萄糖吸收实验技术,通过共聚焦显微镜和流式细胞仪检测GLUT1的质膜分布情况与葡萄糖的吸收情况;采用共转染技术调控肺癌细胞中CAB39与PI3K/AKT通路的表达,应用蛋白免疫印迹（Western blotting）检测PI3Kp85、P-AKT和AKT蛋白表达情况,应用免疫荧光实验技术和葡萄糖吸收实验技术,通过共聚焦显微镜检测GLUT1的质膜分布情况与葡萄糖的吸收情况;应用SPSS22.0统计分析软件处理分析实验数据,以P<0.05表示具有显著性差异。结果:1、肺癌细胞系的筛选。首先,根据我们前期的实验结果,A549和LK2细胞是E6和E7高表达细胞系,而H460细胞系是E6和E7低表达细胞系。因此,我们选择H460细胞系转染p EGFP-N1-HPV16 E6和p EGFP-N1-HPV16 E7质粒,而在A549和LK2两种细胞系中转染E6和E7小si RNA干扰体。其次,我们在研究miR-451和CAB39在调节GLUT1向质膜转运中的作用在肺癌细胞中测试了3种肺癌细胞系（A549、LK2、H460）,应用实时定量聚合酶链反应实验检测miR451m RNA的表达情况,蛋白免疫印迹实验检测CAB39蛋白的表达情况,免疫荧光实验技术和葡萄糖吸收实验技术检测GLUT1的质膜分布情况与葡萄糖的吸收情况,选择人支气管上皮细胞（HBE）作为miR-451和CAB39表达水平的对照,高于HBE被认为是高表达,低于HBE被认为是低表达。我们发现miR-451的表达水平在LK2较高,但在A549和H460中较低。CAB39的表达水平在A549肺癌细胞系中较高,在LK2中较中等,在H460中较低。在所有三个细胞系中均观察到GLUT1在质膜上的低表达并均发生了低葡萄糖摄取（每个细胞的平均荧光强度）。根据上述结果设计并进行进一步的测定。基于此结果,我们选择在A549和H460细胞系中转染miRNA-451的模拟物,在LK2细胞系中转染miRNA-451的抑制物;选择在H460和LK2细胞系中转染CAB39的质粒,在A549和LK2细胞系中转染小si RNA干扰其内源CAB39的表达。2、HPV16 E6/E7下调miR-451的表达,但上调CAB39,PI3K（P85α）,P-AKT（ser473）和GLUT1的表达。将p EGFP-N1-E6或E7载体瞬时转染到低表达H460细胞系中,以E6或E7空载体和模拟转染物为对照。结果表明,E6或E7的过表达显着下调了miR-451的表达,但仅在蛋白水平上调了CAB39,PI3K（P85α）和P-AKT（ser473）的表达,并在蛋白水平和m RNA水平上调了GLUT1的表达,而AKT的表达显示极少或无变化。3、敲除E6或E7上调miR-451的表达,下调CAB39,PI3K（P85α）,P-AKT（ser473）和GLUT1的表达。为了进一步验证E6或E7对miR-451、CAB39,PI3K（P85α）,P-AKT（ser473）和GLUT1的调控作用,应用E6或E7特异性Si RNA敲除A549和LK2细胞系中E6或E7的表达,以E6或E7非特异性Si RNA和模拟特异性Si RNA为对照。结果表明,敲除E6或E7显着上调了miR-451的表达,但仅在蛋白水平下调了CAB39,PI3K（P85α）和P-AKT（ser473）的表达,并在蛋白水平和m RNA水平上调了GLUT1的表达,而AKT的表达显示极少或无变化。4、miR-451下调CAB39,PI3K（P85α）,P-AKT（ser473）和GLUT1的表达。将Hsa-miR-451模拟物被瞬时转染到低表达的H460和A549细胞系中,miRNA-mimics和模拟转染物为对照。miR-451的过表达显着下调了蛋白质和m RNA水平上的CAB39和GLUT1的表达,而仅蛋白质水平下调了PI3K（P85α）和P-AKT（ser473）的表达,而AKT的表达显示极少或无变化。5、敲除miR-451上调CAB39,PI3K（P85α）,P-AKT（ser473）和GLUT1的表达。我们转染Hsa-miR-451抑制物在高表达的LK2细胞中,并以miRNA-inhibit和模拟抑制物为对照时,miR-451的低表达显着上调了蛋白和m RNA水平上的CAB39和GLUT1的表达,而仅蛋白质水平上调了PI3K（P85α）和P-AKT（ser473）的表达,而AKT的表达显示极少或无变化。6、CAB39上调PI3K（P85α）,P-AKT（ser473）和GLUT1的表达。将pCMV3-C-Myc-CAB39载体瞬时转染到H460和LK2细胞系中,以pCMV3-C-Myc-空载体和模拟转染物为对照。结果表明,CAB39的过表达显着上调了蛋白和m RNA水平的GLUT1的表达,并且仅在蛋白水平上显着上调了PI3K（P85α）和P-AKT（ser473）的表达,而AKT的表达则几乎极少或没有变化。7、敲除CAB39下调PI3K（P85α）,P-AKT（ser473）和GLUT1的表达。应用CAB39特异性si RNA抑制A549和LK2细胞系中CAB39的表达,以CAB39非特异性si RNA和模拟特异性si RNA为对照。结果表明,敲除CAB39下调了GLUT1蛋白和m RNA水平的表达,并且仅在蛋白水平上显着下调了PI3K（P85α）和P-AKT（ser473）的表达,而AKT的表达则几乎极少或没有变化。8、CAB39的过表达显着促进了H460和LK2细胞系中GLUT1的质膜易位和葡萄糖摄取。图像分析数据表明,仅在CAB39转染的质膜上检测到GLUT1表达,而在空载体转染的质膜上未检测到。与用空载体转染的质膜相比,在H460（45.5%）和LK2（67.1%）细胞中,转染的CAB39在质膜上的GLUT1表达百分比显着更高。流式细胞仪数据显示,用CAB39转染的H460细胞的葡萄糖平均密度比用空载体转染的H460细胞高3.3倍,而用CAB39转染的LK2细胞比用空载体转染的LK2细胞高2.0倍。9、CAB39对GLUT1的激活取决于PI3K/AKT途径。为了进一步验证CAB39的促进作用是否依赖于PI3K/ATK途径,我们在CAB39转染的H460和LK2细胞系中使用了特异的PI3K/AKT阻滞剂Miltefosine来抑制PI3K/AKT途径,以转染DMSO为对照。结果表明,CAB39对GLUT1蛋白表达,质膜易位和葡萄糖摄取的促进作用被逆转。结论:1、HPV16中的E6和E7蛋白均能解除miR-451对多种肺癌细胞系CAB39的抑制作用;2、CAB39是向质膜转运的关键调控点,上调GLUT1的蛋白和m RNA的表达并促进其膜定位和葡萄糖吸收;3、CAB39诱导的GLUT1的膜定位和葡萄糖吸收增加是通过PI3K/AKT信号通路实现的。