前言:结直肠癌（colorectal cancer CRC）作为最常见的消化道恶性肿瘤之一,严重威胁人类的身心健康。随着国人饮食生活习惯的改变、人口老龄化、环境污染等问题的加重,我国结直肠恶性肿瘤的发生率逐年增长。目前结直肠癌的主要治疗方式仍以外科根治性手术治疗为主,同时,围手术期辅助化疗的作用日益凸显。已经有越来越多的研究证实辅助化疗对结直肠癌患者有益。然而化疗药物的疗效和毒副作用存在着明显的个体差异,最终影响总体治疗结局及预后。分子流行病学研究表明,遗传因素在个体对致癌因素的易感性方面扮演着十分重要的角色,尤其是一些与致癌物质在体内代谢和生物转换相关酶类的基因多态性成为不同个体对相同致癌因素易感程度大小的重要决定因素。谷胱甘肽巯基转移酶（Glutathione S-transferase GST）是体内生物转化最重要的Ⅱ相代谢酶之一,是细胞抗损伤、抗癌变的主要解毒系统。在解毒致癌物,激活抗肿瘤前体药物,代谢化疗剂,以及参与细胞周期和凋亡调控等方面均发挥重要作用。GST基因多态性可能影响所编码的酶的功能,导致其表达和活性的变化,因而进一步导致对癌症风险的影响。谷胱甘肽S-转移酶P1（GSTP1）定位于染色体11q13,全长2.8kb,由7个外显子和6个内含子组成。通过PubMed数据库GeenBank检索,在GSTP1基因启动子区、外显子区,3’UTR区等区域均存在SNP位点。目前,对于GSTP1基因多态性研究最多的SNP位于GSTP1基因第5外显子区（rs1695）,其发生第313位点A→G的碱基替代,可导致蛋白质肽链第105位氨基酸由ATC异亮氨酸（Ile）变为GTC缬氨酸（Val）,进而改变了氨基酸的体积和疏水性,使其编码的蛋白质的热稳定性下降和特异性催化活性降低。基于GSTP1作为II相代谢酶所具有的生物学功能,目前大部分针对rs1695的研究聚焦于其影响编码蛋白的表达与含铂类药物化疗敏感性及预后,化疗药物代谢、化疗药相关不良反应方面,由于GSTP1不同基因型分布频率具有明显的种族、地域差异,其与结直肠癌患病风险的相关性仍存在争议。近期,我们筛选了GSTP1基因潜在的功能性标签SNP（tagSNP）,除了目前研究较多的GSTP1Ile105Val多态外,GSTP1启动子区rs6591256位点存在SNP,具有A-G多态。前期研究报道rs6591256多态与前列腺癌发病风险相关,与台湾地区抽动秽语综合症易感性相关联,同时在非裔美国人口中与rs6591256相关11号染色体单倍体型CTACGAGGCC可能导致患哮喘几率增加近5倍。目前,rs6591256多态与结直肠癌的关系尚未见报道。由于肿瘤是多基因,多步骤致病的复杂疾病,受遗传及环境等多因素影响,单一基因多态的识别能力有限,多因素联合检测具有更明显的优势。本研究期望通过病例对照研究探讨GSTP1基因启动子区rs6591256多态性及其与环境因素共同作用对中国人结直肠癌发病风险和预后的影响,为结直肠癌的个体化诊断和预防、进一步阐明结直肠癌易感机制提供实验依据和进一步研究思路。研究方法:1、病例选择选取中国医科大学附属第一医院肛肠外科2012年12月—2016年6月收治患者共计637例,其中术后病理诊断为结直肠癌的患者310例,设为实验组;经结肠镜检查及直肠指诊无结直肠恶性肿瘤,病理诊断为直肠肛门良性疾病患者327例,设为对照组。2、病例组临床随访及信息收集术后每半年对实验组患者进行电话随访,随访总体生存期（OS）,远处转移情况,收集随访资料。采用问卷调查形式收集对照组及病例组的基本信息,这些基本信息包括年龄、性别以及吸烟和饮酒状态。通过病历资料采集结直肠癌患者的详细临床信息,包括病理信息及血脂分析结果等。在亚组分析中,排除了上述任一变量的数据有缺失的受试者。3、GSTP1基因启动子区rs6591256多态SNP测序分型利用KASP方法对全部637例样本进行GSTP1rs6591256多态测序。4、GSTP1基因启动子区rs6591256多态及其与环境因素交互与结直肠癌发病风险关联分析采用多因素Logistic回归分析法（Logistic regression,LR）评估GSTP1基因启动子区rs6591256多态性与结直肠癌发病风险的相关性。计算基因型及基因组模型的优势比（ORs）及其95%置信区间（CI）。经年龄、性别调整后,采用全因子模型计算各基因型与吸烟及饮酒的交互作用总P值。采用SPSS 22.0版（SPSS Inc.美国芝加哥IL）软件进行统计学分析。所有检验的显著水平均设定为双侧p<0.05。5、GSTP1基因rs6591256多态及其与吸烟饮酒交互作用与结直肠癌临床病理参数关联分析采用多因素Logistic回归分析法计算GSTP1基因rs6591256多态与结直肠癌多种临床病理参数的相关风险程度。采用全因子模型计算各基因型与吸烟及饮酒的交互作用总P值。6、GSTP1基因启动子区rs6591256多态及其与吸烟饮酒交互作用与结直肠癌患者血脂代谢异常关联分析采用多因素Logistic回归分析法计算GSTP1基因rs6591256多态与结直肠癌患者血脂代谢异常的相关风险程度。采用全因子模型计算各基因型与吸烟及饮酒的交互作用总P值。7、GSTP1基因启动子区rs6591256多态及其与吸烟饮酒交互作用与结直肠癌预后关联分析采用Cox比例风险模型进行死亡相关风险的单因素及多因素分析。采用COX回归曲线对rs6591256多态各基因型的生存曲线进行描绘。Log-rank检验用于评估在亚组中不同患者总生存期差异的显著性。经年龄、性别进行调整,采用全因子模型计算各基因型与吸烟及饮酒的交互作用总P值。8、GSTP1蛋白免疫组化染色及评分采用免疫组织化学方法检测310例结直肠癌标本GSTP1蛋白表达情况。依照双盲法原则,由两名病理医师独立阅片及评分,评分结果不一致时请上级医生会诊以达成共识。免疫组化的结果判定:采用HSCORE方法（Histological score）。9、GSTP1蛋白差异表达与结直肠癌生物学行为关联分析采用卡方检验计算GSTP1蛋白表达与结直肠癌临床病理参数的关系。Log-rank检验用于生存时间的组间比较。10、GSTP1蛋白差异表达与结直肠癌预后关联分析采用Cox比例风险模型对GSTP1差异表达进行与死亡相关风险的单因素及多因素分析。11、GSTP1基因启动子区rs6591256多态与GSTP1蛋白表达关联分析GSTP1基因多态与GSTP1蛋白表达情况的关系用卡方检验进行分析。12、GSTP1启动子活性实验1.化学合成方法分别合成含rs6591256A等位基因和G等位基因的GSTP1启动子区序列片段（上海序贯生物有限公司）,送上海吉凯公司测序鉴定。2.构建pGL3-Basic rs6591256报告质粒。（1）质粒pGL3-Basic的扩增抽提及酶切（2）pGL3-Basic质粒及合成DNA片段单酶切（3）连接反应（4）转化感受肽（5）鉴定3.准备目的细胞4.目的细胞质粒转染5.Luciferase检测13、GSTP1基因启动子区rs6591256多态对启动子活性的影响每孔荧光值为Firefly荧光素酶活性（F值）与Renilla荧光素酶活性（R值）的比值,将每孔平均比值除pGL3-Basic空质粒组每孔平均比值,得到荧光素酶的值。所有数据均用（？）±S表示,不同组间活性比较采用独立样本T检验进行分析。结果:1、GSTP1基因启动子区rs6591256多态性及其与吸烟饮酒交互作用与结直肠癌发病风险关联分析rs6591256G型等位基因携带者与结肠癌发病风险降低相关（GA/AA（OR=0.48,95%CI 0.28-0.82,P=0.007）,（GG+GA vs.AA）（OR=0.47,95%CI 0.28-0.78,P=0.003））。风险降低人群集中于小于60岁人群中,rs6591256GA/AA（OR=0.58,95%CI 0.34-0.92,P=0.020）,rs6591256（GG+GA vs.AA）（OR=0.55,95%CI 0.35-0.86,P=0.009）。该多态与吸烟饮酒交互作用与结直肠癌发病风险相关性均未达到统计学意义(P_interaction>0.05)。2、GSTP1基因启动子区rs6591256多态性及其与吸烟饮酒交互作用与结直肠癌临床病理参数关联分析分层分析中,rs6591256GA/AA基因型携带者（P=0.014）,rs6591256（GG+GA vs.AA）（P=0.025）与男性结直肠癌患者肿瘤浸润深度相关,rs6591256GG/AA基因型携带者与无吸烟史结直肠癌患者的肿瘤浸润深度相关（P=0.021）,rs6591256GA/AA基因型携带者（P=0.039）,rs6591256（GG+GA vs.AA）（P=0.043）与TC正常的结直肠癌患者的肿瘤浸润深度相关。该多态性与吸烟饮酒交互作用与结直肠癌临床病理参数相关性均未达到统计学意义(P_interaction>0.05)。3、GSTP1基因启动子区rs6591256多态性及其与吸烟饮酒交互作用与结直肠癌患者血脂代谢异常关联分析在结直肠癌患者人群中,rs6591256GG/AA基因型携带者血清甘油三酯代谢异常风险增加（OR=4.92,95%CI 1.02-23.62,P=0.047）,GA/AA基因型携带者（OR=0.32,95%CI 0.12-0.82,P=0.017）,（GG+GA vs.AA）（OR=0.39,95%CI 0.16-0.91,P=0.029）血清高密度脂蛋白胆固醇代谢异常风险降低,分层分析发现,在大于60岁、不吸烟及不饮酒人群中,携带rs6591256GA/AA基因型的结直肠癌患者血清高密度脂蛋白胆固醇代谢异常风险降低（大于60岁OR=0.19,95%CI 0.04-0.94,P=0.042）,（不吸烟OR=0.16,95%CI 0.04-0.74,P=0.019）,（不饮酒OR=0.33,95%CI 0.12-0.93,P=0.037）。携带rs6591256（GG+GA vs.AA）（男性OR=0.39,95%CI0.15-0.99,P=0.048）,（不吸烟OR=0.30,95%CI 0.09-0.96,P=0.043）。该多态性与吸烟饮酒交互作用与结直肠癌患者血脂代谢异常相关性均未达到统计学意义(P_interaction>0.05)。4、GSTP1基因启动子区rs6591256多态性及其与吸烟饮酒交互作用与结直肠癌预后关联分析对于rs6591256多态而言,总体分析的多因素分析中,rs6591256（GG+GA vs.AA:HR=0.48,95%CI 0.23-0.97,P=0.040）是结直肠癌患者预后好的相关因素,并且该多态与直肠癌患者预后好相关性更为明显（GG+GA vs.AA:HR=0.37,95%CI0.16-0.88,P=0.025）。该多态性与吸烟饮酒交互作用与结直肠癌预后相关性均未达到统计学意义(P_interaction>0.05)。5、GSTP1蛋白表达与结直肠癌临床病理参数关联分析GSTP1蛋白表达在总体人群中与临床病理参数均未发现显著相关性。分层分析发现发现60岁以上结直肠癌患者中,周围神经侵犯阳性者的GSTP1蛋白表达高于阴性者,（阴阳性P=0.010,表达等级P=0.017）,脉管癌栓阴性者的GSTP1蛋白表达高于阳性者（P=0.038）,在不吸烟结直肠癌患者中,高分化组织学类型的GSTP1蛋白表达高于低分化组织学类型者（P=0.014）,在不饮酒结直肠癌患者中,周围神经侵犯阳性的GSTP1蛋白表达高于阴性者（阴阳性P=0.028,表达等级P=0.020）。6、GSTP1蛋白表达与结直肠癌预后关联分析GSTP1蛋白表达的高低与结直肠癌总生存时间之间无显著相关性。分层分析后发现,在单因素分析中,在结直肠癌人群中,不吸烟患者GSTP1蛋白低表达者比高表达者拥有更长的生存期（HR=0.42,95%CI 0.21-0.86,P=0.018）。7、GSTP1基因启动子区rs6591256多态性与GSTP1蛋白表达关联分析总体分析表明GSTP1基因rs6591256多态与GSTP1蛋白表达之间无明显相关性,分层分析发现,在吸烟的结直肠癌患者中GSTP1rs6591256多态与GSTP1蛋白表达之间存在相关性（AG vs AA P=0.022,GG+AG vs AA P=0.026）。8、GSTP1基因启动子区rs6591256多态性对启动子活性的影响GSTP1_rs6591256 G等位基因的启动子活性较A等位基因的启动子活性下降（0.620±0.056 vs 0.806±0.052,P=0.014）。结论:1、GSTP1基因启动子区rs6591256多态性与结肠癌发病风险降低具有相关性,小于60岁人群,rs6591256突变型基因型（GA/AA）携带者患结直肠癌的风险降低。2、GSTP1基因启动子区rs6591256多态性与吸烟、饮酒等环境因素对结直肠癌发病风险未见明显交互作用。3、GSTP1基因启动子区rs6591256多态性与结直肠癌的浸润深度相关。4、GSTP1基因启动子区rs6591256多态与结直肠癌患者TG代谢异常风险增加相关,但与HDL-C代谢异常风险降低相关。5、GSTP1基因启动子区rs6591256GG+GA多态基因型与结直肠癌患者,特别是直肠癌患者良好预后相关。6、GSTP1蛋白表达与结直肠癌患者组织学类型、周围神经侵犯状态、脉管癌栓状态之间存在相关性。7、GSTP1蛋白低表达与不吸烟结直肠癌患者良好预后相关。8、在吸烟人群中GSTP1基因启动子区rs6591256多态可以影响结直肠癌GSTP1蛋白的表达。9、GSTP1基因启动子区rs6591256多态可能通过降低启动子活性进而影响GSTP1蛋白表达。