磷是生命的核心元素之一,阐明磷调控基因的功能,对认识生物体内磷代谢的基因表达网络和发现磷高效利用基因都具有重要意义。at5g55690是属于MADs-Box蛋白家族的转录因子基因,基因编码蛋白产物AGAMOUS-LIKE 47(AGL47),该家族基因在植物的营养生长和繁殖等方面都是关键的调控因子。前期研究显示, at5g55690基因的表达受磷营养胁迫的特异调控,极有可能在磷调控中发挥重要的作用。为了进一步鉴定该基因的功能,本研究对该基因的过量表达突变株在水培条件下进行了生理测定。构建酒精诱导过量表达突变体,并完成了AGL47蛋白的原核表达,为明确该基因功能奠定了基础。主要研究结果如下:1过量表达at5g55690基因的拟南芥突变株生理分析。(1)过量表达突变体鉴定。前期研究创制的过量表达突变株T0代种子播撒于含有潮霉素抗性素的1/2MS培养基上,筛选出潮霉素抗性突变株。用特异PCR方法鉴定出突变株2为阳性突变株,半定量RT-PCR方法分析显示突变株at5g55690基因表达量增加显著。(2)过量表达at5g55690基因促进了拟南芥的营养生长,抽薹延迟。低磷(10μM)水培体系中,过量突变株单株与对照哥伦比亚野生型拟南芥相比,抽薹和结荚的日期均晚一天。在全营养(500μM)水培体系中,野生型拟南芥第14天抽薹,第16天结荚,此时抽薹率达到100%,过量表达突变株第14天抽薹,第16天未见有结荚,此时抽薹率为90%。(3)过量表达at5g55690基因促进低磷条件下拟南芥的生长。低磷(10μM)水培体系中,过量表达at5g55690基因的拟南芥突变株单株与对照哥伦比亚野生型拟南芥相比, 16天后整株鲜重增加123.70%,整株干重增加91.38%,根长增加19.50%,根干重增加52.46%。在全营养(500μM)水培体系中,过量表达突变株与野生型相比也有增加, 16天整株鲜重增加93.12%,整株干重增加77.78%,根长增加27.99%,根干重增加144.57%。(4)过量表达at5g55690基因能提高拟南芥对磷的吸收量,并影响磷在拟南芥地上部/地下部磷含量的分配。低磷(10μM)水培体系中,突变株单株与对照哥伦比亚野生型拟南芥相比,磷吸收量增加96.3%。在全营养(500μM)水培体系中,磷吸收量增加53.88%。过量表达at5g55690基因使拟南芥减少了低磷和全营养条件下地上部/地下部磷分配的变化。低磷(10μM)水培体系中,过量表达突变株地上部含磷量是地下部的4.55倍,野生型拟南芥地上部含磷量是地下部5.90倍。过量表达突变株地上部含磷量是地下部的4.01倍,野生型拟南芥地上部含磷量是地下部的1.74倍。(5)过量表达at5g55690基因降低了拟南芥对低磷胁迫的生理反应敏感性。缺磷(0μM)和低(10μM)磷水培体系时,过量表达突变株的根冠比( Ratio of root/shoot ,R/S)比野生型小。过量表达at5g55690基因有促进根生长的作用,因此全营养水培体系中,过量表达突变株比野生型拟南芥根冠比(R/S)要大。2酒精诱导at5g55690基因过量表达实验体系建立。郑文明等(2007)把at5g55690的全长ORF定向克隆到酒精诱导表达载体pSRN上,构建重组载体PSRN-at5g55690,农杆菌法转染拟南芥创制酒精酒精诱导过量表达突变株。本实验对酒精诱导过量表达突变株拟南芥进行浓度梯度和时间梯度诱导,用半定量RT-PCR方法检测at5g55690基因在植株体内的表达量。结果显示0. 25%酒精对突变株诱导最合适,诱导时间2小时左右可以达到最佳的诱导效果,这时可取样做为下一步chip sequence实验的材料。为进一步研究该基因的下游靶基因和互作蛋白奠定了基础。3 AGL47蛋白原核表达分析结果。克隆at5g55690基因的全长ORF与表达载体Pet-28a定向连接从而构建重组载体pet-28a-at5g55690,转入E.coli DH5α后提取阳性菌株的质粒进行双酶切及测序鉴定。重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导下实现了AGL47蛋白的原核表达,融合蛋白以包涵体的形式存在。通过对包涵体的纯化,变性,复性,初步获得了可溶性融合蛋白。