论文部分内容阅读
目的：研究BMP．2诱导MCSCs向心肌细胞分化中细胞的形态结构和电生理特征变化，明确Smad信号通路在BMP．2诱导的MCSCs向心肌细胞分化中的调控作用，探讨MCSCs向心肌细胞分化的信号转导机制。
方法：从SD大鼠骨髓中分离MMSC，通过单克隆培养技术、c-kit免疫荧光标记和用RT-PCR检测心肌早期转录因子Nkx2.5的表达，从MMSC中筛选出具有心肌特异分化潜能的MCSCs。用BMP-2诱导MCSCs向心肌细胞定向分化。在MCSCs分化过程中，用相差显微镜观察细胞的形态变化，用免疫细胞化学检测细胞心肌特异性蛋白cTnT的表达，用全细胞膜片钳技术记录细胞的AP和ICa-L。采用westemblot和免疫细胞化学法检测细胞内磷酸化Smadl／5／8的表达及其分布特点的变化。用RT-PCR检测诱导后细胞的GATA-4和cTnTmRNA表达变化。用Smad信号抑制剂SB203580处理细胞后，观察对磷酸化Smadl／5／8表达及其分布和对GATA-4和cTnTmRNA表达的影响。
结果：从MMSC克隆中筛选出表达Nkx2.5的c-kit+MMSC克隆，即MCSCs。用BMP．2诱导后，细胞的形态和排列方式发生明显变化。诱导后4周，可见多个细胞相互连接形成肌管样结构。MCSCs不表达cTnT，诱导后2周开始表达，3～4周表达增强，呈现密集的横纹样结构。诱导后3周，可记录到具有心室肌细胞特点的AP，但平台期不明显。4周细胞的AP出现明显的平台期，类似于成年大鼠心室肌细胞的AP。诱导后3周可记录到ICa-L,但电流值较小。4周细胞ICa-L的电流值增大，激活电位为-40mv，最大激活电位为0mV，反转电位为+60mV，与成年大鼠心室肌细胞的ICa-L相似。BMP一2诱导后15min，细胞内可检测到磷酸化Smad1／5／8的表达，30min和1h表达明显增加，1h后开始降低，4h呈低表达。l5min时磷酸化的Sm甜1／5／8仅见于胞质中，30min时胞质和胞核均见表达，1h主要在胞核内表达。诱导后2周，细胞明显表达GATA-4和cTnTmRNA，4周的细胞GAIA-4和cTnTmRNA表达增强。抑制Smad信号后，磷酸化Smadl／5／8的表达显著降低，细胞核内未见明显表达，GATA-4和cTnTmRNA的表达显著降低，细胞的形态未见明显变化。
结论：骨髓中含有具有心肌特异性分化潜能的MCSCs，BMP．2能够诱导MCSCs向心肌细胞分化，分化后的细胞在形态结构和电生理方面具备了功能性心肌细胞的特征。Smad信号通路在BMP一2诱导MCSCs向心肌细胞分化中发挥重要的调控作用。