胰岛素对猪颗粒细胞黄体化的影响

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哺乳动物围产期胰岛素抵抗作为一种较为常见的妊娠后期和泌乳早期特有并发症,是影响围产期母猪繁殖力,制约养猪业发展的关键障碍之一。研究表明,胰岛素可以通过影响黄体形成来影响哺乳动物繁殖力,而颗粒细胞黄体化对于黄体形成和功能维持是必不可少的,但胰岛素对颗粒细胞黄体化的影响还未清楚。本研究以猪卵巢颗粒细胞为实验材料,通过Ed U、CCK-8和ELISA检测了胰岛素对猪颗粒细胞的增殖、细胞活力、激素分泌和黄体化的影响;结合转录组测序、MDC染色、电镜分析和Western Blot(WB)等研究自噬,特别是自噬体数量的变化对胰岛素诱导猪颗粒细胞黄体化的影响。本研究为进一步阐明围产期胰岛素抵抗的发病机理和制定相应的治疗方案,以及胰岛素调控卵泡发育的机理等提供理论依据和数据支撑。取得如下研究结果:1.胰岛素影响猪颗粒细胞功能通过ELISA、EDU和CCK-8检测胰岛素对猪颗粒细胞功能的影响。结果表明,胰岛素可以促进猪颗粒细胞的增殖,促进猪颗粒细胞分泌类固醇激素;胰岛素(2μg/m L)处理猪颗粒细胞3 d可诱导猪颗粒细胞黄体化:孕激素浓度显著升高(P<0.01),黄体化相关基因STAR、3β-HSD表达量显著升高(P<0.01);收集猪颗粒细胞和胰岛素诱导猪颗粒细胞黄体化后的猪颗粒黄体细胞进行转录组测序,结果表明,在胰岛素诱导猪颗粒细胞黄体化过程中,差异基因除富集在MAPK、STAT和ERK等信号通路外,还富集到m TOR、溶酶体(Lysosome)、自噬泡(Phagosome)、线粒体自噬(Mitophagy)等自噬相关信号通路(Autophagy-animal),提示自噬在胰岛素诱导猪颗粒细胞黄体化的过程中发挥作用。2.自噬在胰岛素诱导猪颗粒细胞黄体化过程中发挥作用通过QRT-PCR、MDC染色、透射电镜和WB检测胰岛素诱导猪颗粒细胞黄体化过程中的自噬水平,结果表明,在胰岛素诱导猪颗粒细胞黄体化的过程中,虽然自噬体数量增加,但p62和LC3表达水平的降低表明自噬水平降低。通过ELISA、QRT-PCR检测自噬体降解抑制剂氯喹(CQ)和自噬体生成抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)对胰岛素诱导2天后的猪颗粒黄体细胞黄体化水平的影响。结果表明,抑制自噬,猪颗粒黄体细胞的黄体化水平升高;抑制自噬体降解显著提高猪颗粒黄体细胞的黄体化水平。CCK-8、Ed U和流式细胞术检测CQ对胰岛素诱导2天后的猪颗粒黄体细胞增殖和凋亡的影响。结果表明,抑制自噬体降解会促进猪颗粒黄体细胞的增殖,抑制猪颗粒黄体细胞的凋亡。以上结果表明:胰岛素促进猪颗粒细胞增殖和类固醇激素的分泌,可以诱导猪颗粒细胞黄体化。在胰岛素诱导猪颗粒细胞黄体化的过程中,自噬体数量增加,自噬水平降低;抑制自噬体降解(自噬体增加),促进了猪颗粒黄体细胞的增殖,抑制了猪颗粒黄体细胞的凋亡,从而促进了黄体化进程。
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