论文部分内容阅读
白细胞介素1受体相关激酶4(interleukin-1 receptor-associated kinase 4， IRAK4)是先天免疫系统Toll样受体家族信号通路的重要成员之一。本研究利用池蝶蚌(Hyriopsis schlegelii)性腺转录组获得池蝶蚌IRAK4基因的序列信息，采用RACE-PCR技术首次获得池蝶蚌IRAK4基因的cDNA全长序列，定名为HsIRAK4。其全长为2617bp，ORF框1674bp，共编码557个氨基酸，预测分子质量为62.379KD，等电点为5.34，该蛋白显弱酸性。在该氨基酸序列中Leu占有比最高为10.4%，Trp占有比最低为0.7%，且该氨基酸序列含有48个磷酸位点，其中含有4个酪氨酸(Tyr)，13个苏氨酸(Thr)和31个丝氨酸(Ser)。HsIRAK4蛋白包含2个保守结构域，即N端的死亡结构域(Death，DD)和激酶结构域(KD)，氨基酸多重序列比对结果表明，这两个结构域是保守的。系统进化树分析显示，HsIRAK4与青蛤的同源性高达95%，与软体动物聚在一支，和鱼类、灵长类不在一支。
为了探究LPS和嗜水气单胞杆菌对池蝶蚌免疫相关基因(髓样分化因子88(myeloiddifferentiationfactor88,MyD88)和HsIRAK4)表达的影响，采用Realtime-quantitativePCR技术检测池蝶蚌髓样分化因子88(HsMyD88)和HsIRAK4在所有组织中的表达。通过闭壳肌注射LPS和嗜水气单胞杆菌诱导后，与注射PBS为对照，分别在7个时间点(0 h、6 h、12 h、24 h、36 h、48 h、72 h)对10个组织(血、心、肝胰腺、外套膜、闭壳肌、斧足、性腺、肠和鳃)中HsMyD88和HsIRAK4的mRNA表达差异性进行分析。结果显示，在0h时间点，HsMyD88和HsIRAK4均能在所有组织中表达，具有普遍性。并且组织分布结果表明HsMyD88和HsIRAK4在各个组织中的表达具有差异性，HsMyD88在肾脏最高，其次是肝胰腺和肠；HsIRAK4在肝胰腺最高，其次是性腺和肠。在其他时间段，HsMyD88和HsIRAK4在不同组织中均发生不同程度的上调。尤其在肠、肝胰腺、肾脏、心和血中HsMyD88和HsIRAK4的表达水平显著增加。另外，HsMyD88和HsIRAK4同时率先在闭壳肌、肠、肝胰腺、鳃、外套膜这些组织达到第一个峰值，说明这些组织在池蝶蚌的先天免疫机制中发挥着重要作用以及HsMyD88和HsIRAK4之间存在密切的关系。
针对HsIRAK4的分子特征以及功能的预测，我们还进一步还对HsMyD88和HsIRAK4之间的关系进行了研究。通过构建PGEX-4T-1-HsIRAK4-ORF、PGEX-4T-1-HsIRAK4-Death和Pet-32a-HsMyD88-Death重组质粒、原核诱导表达和纯化，进行GST-pulldown，通过SDS-PAGE和WesternBlot检测结果。结果显示，HsMyD88的Death结构域分别能和HsIRAK4的ORF以及Death结构域直接相互作用。充分说明了池蝶蚌MyD88信号通路中HsMyD88能和HsIRAK4发生直接的相互作用，但这一过程并不需要HsIRAK4的激酶属性。
同时，通过从三条siRNA筛选出干扰效果较好的一条RNA干扰链，再累计注射(0 d、4 d、8 d、12 d)，分别检测在注射后2d、6d、10d、14d的肝胰腺中HsMyD88的表达水平。结果显示，通过4次的累计注射，DEPC组和阴性组的HsMyD88的表达几乎没有明显变化，但是在干扰组中，通过累计注射HsMyD88-806干扰链，HsMyD88在肝胰腺中的表达水平出现显著性下降。在第2天，其表达量下降至0.50倍(P＜0.01)；第6天则下降至0.69倍(P＜0.05)，在第10天，表达量下降到了0.47倍(P＜0.05)；到第14天的时候，HsMyD88的表达量已经下降到0.23倍(P＜0.05)。结果表明通过14天的连续注射，HsMyD88在肝脏中才成功被干扰，显著性抑制了HsMyD88的表达。
本论文主要通过RACE-PCR在池蝶蚌的肝胰腺中克隆得到HsIRAK4的cDNA全长序列，进行生物信息学分析发现HsIRAK4具有保守性；LPS和嗜水气单胞杆菌诱导后，HsMyD88和HsIRAK4的mRNA表达水平显著上调。同时，GST-pulldown实验证明HsMyD88的Death结构域可以和HsIRAK4的Death结构域直接相互作用，这一相互作用的发生并不需要HsIRAK4的KD结构域。利用RNA干扰技术对池蝶蚌MyD88进行干扰，显示通过累计注射的方法，能够显著性抑制HsMyD88基因在肝胰腺的表达。上述结果表明，HsMyD88和HsIRAK4参与了池蝶蚌的先天免疫应答，并且二者均在组织中呈现差异性表达。同时，在池蝶蚌中首次揭示了HsMyD88能直接和HsIRAK4相互作用。因此，HsIRAK4在池蝶蚌MyD88依赖信号通路中可能扮演着一个非常重要的角色。这对后续继续探究HsMyD88基因的功能提供了很好的基础。
为了探究LPS和嗜水气单胞杆菌对池蝶蚌免疫相关基因(髓样分化因子88(myeloiddifferentiationfactor88,MyD88)和HsIRAK4)表达的影响，采用Realtime-quantitativePCR技术检测池蝶蚌髓样分化因子88(HsMyD88)和HsIRAK4在所有组织中的表达。通过闭壳肌注射LPS和嗜水气单胞杆菌诱导后，与注射PBS为对照，分别在7个时间点(0 h、6 h、12 h、24 h、36 h、48 h、72 h)对10个组织(血、心、肝胰腺、外套膜、闭壳肌、斧足、性腺、肠和鳃)中HsMyD88和HsIRAK4的mRNA表达差异性进行分析。结果显示，在0h时间点，HsMyD88和HsIRAK4均能在所有组织中表达，具有普遍性。并且组织分布结果表明HsMyD88和HsIRAK4在各个组织中的表达具有差异性，HsMyD88在肾脏最高，其次是肝胰腺和肠；HsIRAK4在肝胰腺最高，其次是性腺和肠。在其他时间段，HsMyD88和HsIRAK4在不同组织中均发生不同程度的上调。尤其在肠、肝胰腺、肾脏、心和血中HsMyD88和HsIRAK4的表达水平显著增加。另外，HsMyD88和HsIRAK4同时率先在闭壳肌、肠、肝胰腺、鳃、外套膜这些组织达到第一个峰值，说明这些组织在池蝶蚌的先天免疫机制中发挥着重要作用以及HsMyD88和HsIRAK4之间存在密切的关系。
针对HsIRAK4的分子特征以及功能的预测，我们还进一步还对HsMyD88和HsIRAK4之间的关系进行了研究。通过构建PGEX-4T-1-HsIRAK4-ORF、PGEX-4T-1-HsIRAK4-Death和Pet-32a-HsMyD88-Death重组质粒、原核诱导表达和纯化，进行GST-pulldown，通过SDS-PAGE和WesternBlot检测结果。结果显示，HsMyD88的Death结构域分别能和HsIRAK4的ORF以及Death结构域直接相互作用。充分说明了池蝶蚌MyD88信号通路中HsMyD88能和HsIRAK4发生直接的相互作用，但这一过程并不需要HsIRAK4的激酶属性。
同时，通过从三条siRNA筛选出干扰效果较好的一条RNA干扰链，再累计注射(0 d、4 d、8 d、12 d)，分别检测在注射后2d、6d、10d、14d的肝胰腺中HsMyD88的表达水平。结果显示，通过4次的累计注射，DEPC组和阴性组的HsMyD88的表达几乎没有明显变化，但是在干扰组中，通过累计注射HsMyD88-806干扰链，HsMyD88在肝胰腺中的表达水平出现显著性下降。在第2天，其表达量下降至0.50倍(P＜0.01)；第6天则下降至0.69倍(P＜0.05)，在第10天，表达量下降到了0.47倍(P＜0.05)；到第14天的时候，HsMyD88的表达量已经下降到0.23倍(P＜0.05)。结果表明通过14天的连续注射，HsMyD88在肝脏中才成功被干扰，显著性抑制了HsMyD88的表达。
本论文主要通过RACE-PCR在池蝶蚌的肝胰腺中克隆得到HsIRAK4的cDNA全长序列，进行生物信息学分析发现HsIRAK4具有保守性；LPS和嗜水气单胞杆菌诱导后，HsMyD88和HsIRAK4的mRNA表达水平显著上调。同时，GST-pulldown实验证明HsMyD88的Death结构域可以和HsIRAK4的Death结构域直接相互作用，这一相互作用的发生并不需要HsIRAK4的KD结构域。利用RNA干扰技术对池蝶蚌MyD88进行干扰，显示通过累计注射的方法，能够显著性抑制HsMyD88基因在肝胰腺的表达。上述结果表明，HsMyD88和HsIRAK4参与了池蝶蚌的先天免疫应答，并且二者均在组织中呈现差异性表达。同时，在池蝶蚌中首次揭示了HsMyD88能直接和HsIRAK4相互作用。因此，HsIRAK4在池蝶蚌MyD88依赖信号通路中可能扮演着一个非常重要的角色。这对后续继续探究HsMyD88基因的功能提供了很好的基础。