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尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-glucose pyrophosphorylase,UgP)在植物中广泛分布,是糖类代谢中的一个关键酶。水稻基因组中有三个Ugp同源基因。其中两个已分别从花药、胚乳中克隆到,在此定名为:OsUgp2、OsUgp1;另外一个为预测基因,命名为OsUgp3。
本研究通过克隆上述三个基因的启动子,并与gus嵌合转化水稻,分析研究这三个基因在水稻中的表达模式及可能的趋异表达机制。此外,将偏爱在花粉中表达的OsUgp2基因的启动子与bamase融合转化水稻、与gus融合转化拟南芥,研究该启动子进一步应用的可能性。获得如下实验结果:
(1)克隆了OsUgp2基因5’端上游约3kb长度的启动子片段Pos23k。Pos23k/GUS转基因水稻根、茎、叶、小穗等不同组织的GUS染色结果显示:转基因植株仅在二核时期的花粉中可以检测到GUS活性,在成熟期的少量花粉中也可以检测到很高的GUS显色反应,表明Pos23k是一种花粉特异的启动子。该试验结果与黄子英(2005)克隆到的该基因全长1957bp的启动子片段Pos22k驱动gus在水稻中的表达模式一致,说明OsUgp2基因上游2k~3k的区段并没有控制OsUgp2在成熟花粉中大量表达的相关元件。
(2)水稻花粉特异表达的启动子Pos22k、Pos23k与barnase基因嵌合转化水稻。转基因植株营养体的生长状况与未转化植株相比基本是一样的,但花粉的可染率及植株的结实率明显下降,结实率介于096~37%。说明Pos22k、Pos23k启动barnase基因在花药/花粉中特异表达,破坏了花粉或花药组织的结构,阻断花粉的正常发育,引起雄性不育。
(3)对Pos22k/GUS、Pos23k/GUS转基因拟南芥根、茎、叶、不同发育时期的花、果荚等组织进行GUS组织化学染色,结果显示:转基因植株的上述组织中均可以检测到GUS活性。在花粉发育阶段,小孢子时期GUS不表达或表达量少,随着花粉的成熟GUS染色颜色加深,在二核期可以检测到明显的GUS的活性,但染色较浅,在成熟期的花粉中可以检测到高的GUS活性,染色最深,而且在萌发的花粉管中也都有gus表达,表明水稻花粉特异表达的Pos22k和Pos23k启动子在拟南芥中的表达模式发生了改变,预示该花粉组织特异性启动子可能不适宜应用于双子叶植物中。
(4)克隆水稻Ugp家族另外两个成员基因OsUgp1和OsUgp3的启动子片段Pos1、Pos3,分别与gus基因嵌合转化水稻。GUS组织化学染色结果显示:Pos1驱动gus在转基因水稻的各种组织器官中均有表达,在减数分裂时期的花药中也有很高的表达量;而Pos3/GUS转化植株正常生长条件下,在转基因水稻各个组织和花粉发育的各个时期均没有检测到GUS活性,但在4℃冷处理两天的Pos3/GUS单拷贝T1代幼苗根中检测到很高的GUS活性,推测OsUgp3基因可能是一个受冷胁迫诱导表达的基因。
(5)运用植物启动子分析相关数据库,着重分析了三个Ugp基因启动子区与水稻Ugp基因家族三成员趋异表达的主要区别(花粉特异、胚乳和冷胁迫)相关的作用元件。初步的分析结果显示三个Ugp基因启动子区含有的上述相关顺式作用元件种类区别不大,其不同的表达模式可能由单个元件的数量、位置或转录因子的存在与否共同决定的。