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目的
高血压心室重构(Ventricular Remodeling，VR)包括心肌实质重构和间质重构，导致心脏形态结构和血流动力学异常，左室进行性扩大，收缩功能逐渐降低，最终导致心力衰竭和死亡，严重危害着人们的身心健康。因此，深入研究高血压心室重构的防治机制，具有重要意义。目前大量实验研究证明，肾素-血管紧张素-醛固酮系统(renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS)在心室重构的形成和病理进展中发挥着重要的作用。血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)是RAAS的主要效应物质，可通过多种途径介导心室重构的形成。已有研究表明，AngⅡ能够诱导活性氧(reactive oxygenspecies，ROS)的过量产生和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamideadenine dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶活性升高，引起心室重构。氧化应激信号通路中重要的下游信号分子是核因子κB(nuclearfactorkappa-B，NF-κB)。大川芎方出自刘完素《宣明论方》，是临床早期调整脏腑的阴阳气血，逆转高血压靶器官损伤的基础方剂，且副作用小、经济、安全，但其对高血压心室重构的改善机制不清，成为限制其进一步研究开发和临床应用的瓶颈。那么，大川芎方改善高血压心室重构是否通过抑制氧化应激和NADPH/NOS/NF-κB信号通路发挥作用，是本研究拟解决的主要问题。因此，在前期工作的基础上，拟探讨大川芎方对自发性高血压大鼠(spontaneous hypertension rats，SHR)心室重构及AngⅡ诱导的H9c2心肌细胞损伤的干预效应及可能机制，主要明确大川芎方对高血压大鼠心室肥大、心肌纤维化、氧化应激的异常是否具有防治作用，以及对心肌细胞NADPH/ROS/NF-κB信号通路异常活动的调控作用。
方法
选用12周龄雄性无特定病原体级(SPF级)SHR大鼠40只和Wistar-Kyoto(WKY)大鼠10只，随机分为:空白对照组(WKY组)、模型组(SHR组)、SHR+大川芎方高剂量组、SHR+大川芎方低剂量组、SHR+氨氯地平组。连续用药干预六周，1次/日。给予等体积的蒸馏水灌胃空白对照组以及模型组。干预前测量血压一次，干预开始后每周测量血压一次。干预六周后计算心肌肥厚指数(心脏质量/体重，即HW/BW)的值从而定量心肌肥厚的程度。HE染色法观察心肌形态结构变化；天狼星红染色法观察心肌纤维化程度；PCR检测心房利钠因子(ANF)和β-肌球蛋白重链(β-MHC)mRNA的表达；Western-blot检测NOX2、NF-κBp65、NOX4蛋白的表达。
体外培养H9c2细胞，采用AngⅡ(0.1mol/L)来诱导心肌细胞损伤模型。观察大川芎方含药血清对AngⅡ诱导的H9c2细胞损伤的影响。H9c2细胞的处理和分组为:空白对照组、空白血清组、含药血清组、AngⅡ组、AngⅡ＋空白血清组、AngⅡ＋含药血清组。CCK-8法检测H9c2细胞的活力；DHE荧光法检测ROS活性；PCR检测ANF和β-MHCmRNA的表达；Western-blot检测NOX2、NF-κBp65、NOX4蛋白的表达。
结果
第一部分：
1.大川芎方可降低SHR大鼠动脉血压。与WKY组相比，SHR组大鼠收缩压显著升高(P＜0.05)；与SHR组相比，三个治疗组6周治疗结束后血压均显著下降(P＜0.05)；与大川芎方低剂量组相比，大川芎方高剂量组和氨氯地平组效果更佳(P＜0.05)。说明一定剂量大川芎方可有效降低高血压大鼠的动脉血压。
2.大川芎方可降低高血压大鼠心肌肥厚指数。与WKY组比较，SHR组的HW/BW明显增大(P＜0.01)；与SHR组相比，各治疗组的HW/BW均有降低(P＜0.05)。说明大川芎方可显著抑制高血压大鼠的心室肌肥厚。
3.大川芎方可改善SHR大鼠左心室的心肌形态结构。HE染色结果显示：WKY组大鼠的心肌细胞排列不紊乱，形态规则，无肌纤维断裂或溶解现象，胞核均匀分布，没有发生变性坏死，没有炎性细胞浸润，无心室重构发生；SHR组心肌细胞及胞核横截面积变大，排列不规则，发生多处断裂或溶解，胞核大小不一，胞质嗜酸性增强，伴有大量炎细胞浸润，发生明显的心室重构。与SHR比较，SHR+大川芎方低浓度组大鼠心肌细胞存在不同程度肥大，发生心室重构；SHR+氨氯地平组、SHR+大川芎方高剂量组的病变程度较SHR组有所改善，有排列较为整齐的心肌细胞，没有明显肥大发生，炎性细胞少见。对各组大鼠的心肌细胞横截面积定量分析发现，与WKY组相比，SHR组心肌横截面积显著增大(P＜0.01)；与SHR组相比，治疗组能够降低心肌横截面积(P＜0.05)，其中SHR+大川芎方高剂量组和SHR+氨氯地平组效果更显著(P＜0.01)。提示一定剂量的大川芎方能够改善高血压大鼠的心肌肥大。
4.大川芎方可以改善SHR大鼠左心室的心肌纤维化。天狼星红染色显示：WKY组多为黄色为主的心肌纤维，心肌细胞间质及心肌血管周围有少量的红色胶原纤维，但是SHR组大鼠的心肌间质及其血管周围存在大量纵横交织的红色胶原纤维。和SHR组相比较，SHR+氨氯地平和SHR+高低剂量大川芎方处理后可以明显改善心肌组织胶原蛋白的沉积。对心室肌组织切片的血管周边胶原容积分数分析发现，各治疗组较SHR组心肌纤维化程度有所改善(P＜0.05)，其中SHR+大川芎方高剂量组和SHR+氨氯地平组效果最为显著(P＜0.01)。表明一定剂量的大川芎方可以改善高血压大鼠的心肌纤维化。
5.大川芎方可以抑制SHR大鼠心肌肥大标志性基因ANF，β-MHCmRNA表达。结果显示，与WKY组相比较，SHR组心肌组织中ANF，β-MHCmRNA表达明显增高(P＜0.01)；各治疗组与SHR组组比较，mRNA水平明显降低(P＜0.01)；SHR+大川芎方高剂量组、SHR+氨氯地平组与SHR+大川芎方低剂量组比较明显降低(P＜0.01)。说明大川芎方能够降低心肌组织中ANF，β-MHCmRNA表达。
6.大川芎方可以降低SHR大鼠心肌组织NOX2、NOX4蛋白水平表达，并抑制NF-κBp65核转移。与WKY组相比，SHR大鼠心肌组织的NOX2、NOX4及胞核中NF-κBp65的蛋白表达水平均明显增加(P＜0.01)；与SHR组相比，各治疗组蛋白表达水平明显下降(P＜0.01)，且SHR+大川芎方高剂量组蛋白表达效果最佳。与WKY组相比，SHR大鼠心肌组织胞浆中NF-κBp65的蛋白表达水平明显降低(P＜0.01)；各治疗组蛋白表达水平明显升高(与SHR组相比)(P＜0.01)，且SHR+大川芎方高剂量蛋白表达效果最佳。表明大川芎方能够降低NOX2、NOX4蛋白水平，并可抑制NF-κBp65发生核转移。
第二部分：
1.大川芎方含药血清对H9c2细胞的影响。结果显示，不同浓度(10%，15%，20%， 25%，30%)大川芎方含药血清对H9c2细胞活力的影响没有显著性差异(P＞0.05)。说明大川芎方含药血清对心肌细胞无明显毒性作用。
2.大川芎方含药血清对H9c2细胞活力的影响。各组心肌细胞与相应干预措施作用48h后，结果显示，AngⅡ组细胞活力显著低于空白对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)；AngⅡ+25%含药血清组及AngⅡ+30%含药血清组细胞活力明显高于AngⅡ组，差异有统计学意义(P＜0.05)，25%含药血清差异显著(P＜0.01)。取浓度为25%的含药血清作为后续实验条件。
3.大川芎方含药血清可抑制AngⅡ诱导的ROS生成。结果显示：与空白组相比，AngⅡ刺激心肌细胞24h后，细胞内的红色荧光强度显著增强，可以说明ROS的生成增多。用25%大川芎方含药血清处理经AngⅡ刺激24h后心肌细胞，细胞内的红色荧光强度减弱，接近正常水平，表明大川芎方含药血清可抑制AngⅡ诱导的ROS的生成。
4.大川芎方含药血清对AngⅡ诱导的心肌肥大标志性基因ANF和β-MHCmRNA表达的影响。结果显示，与空白组相比较的情况下，AngⅡ组的心肌细胞肥大标志性基因ANF和β-MHCmRNA的表达量明显增高，具有显著性差异(P＜0.01)。25%空白血清组、25%含药血清组与空白组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。与AngⅡ组相比，AngⅡ+25%含药血清组心肌细胞ANP和β-MHCmRNA表达水平显著降低，差异具有统计学意义(P＜0.01)。
5.大川芎方含药血清可以降低AngⅡ诱导的H9c2细胞NOX2、NOX、NF-κBp65蛋白水平表达。结果表明，与空白组相比，AngⅡ组中心肌组织NOX2、NOX4及胞核中NF-κBp65的蛋白表达水平明显增加(P＜0.01)；25%空白血清组、25%含药血清组与空白组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)；与AngⅡ组相比，AngⅡ+25%大川芎方含药血清组心肌细胞NOX2、NOX4及胞核中NF-κB的蛋白表达水平明显下降(P＜0.01)。与空白组相比，AngⅡ组胞浆中NF-κBp65的蛋白表达水平明显降低(P＜0.01)；25%空白血清组、25%含药血清组与空白组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)；与AngⅡ组相比，AngⅡ+25%大川芎方含药血清组心肌细胞胞浆中NF-κBp65的蛋白表达水平明显升高(P＜0.01)。说明大川芎方含药血清可以降低NOX2，NOX4的蛋白水平，还能抑制NF-κBp65发生核转移。
结论
1大川芎方可改善高血压模型的左心室心肌肥厚、心肌纤维化和超氧化物的产生。
2.大川芎方可能通过NADPH/ROS/NF-κB信号通路来抑制氧化应激和炎症反应从而改善高血压心室重构。
高血压心室重构(Ventricular Remodeling，VR)包括心肌实质重构和间质重构，导致心脏形态结构和血流动力学异常，左室进行性扩大，收缩功能逐渐降低，最终导致心力衰竭和死亡，严重危害着人们的身心健康。因此，深入研究高血压心室重构的防治机制，具有重要意义。目前大量实验研究证明，肾素-血管紧张素-醛固酮系统(renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS)在心室重构的形成和病理进展中发挥着重要的作用。血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)是RAAS的主要效应物质，可通过多种途径介导心室重构的形成。已有研究表明，AngⅡ能够诱导活性氧(reactive oxygenspecies，ROS)的过量产生和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamideadenine dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶活性升高，引起心室重构。氧化应激信号通路中重要的下游信号分子是核因子κB(nuclearfactorkappa-B，NF-κB)。大川芎方出自刘完素《宣明论方》，是临床早期调整脏腑的阴阳气血，逆转高血压靶器官损伤的基础方剂，且副作用小、经济、安全，但其对高血压心室重构的改善机制不清，成为限制其进一步研究开发和临床应用的瓶颈。那么，大川芎方改善高血压心室重构是否通过抑制氧化应激和NADPH/NOS/NF-κB信号通路发挥作用，是本研究拟解决的主要问题。因此，在前期工作的基础上，拟探讨大川芎方对自发性高血压大鼠(spontaneous hypertension rats，SHR)心室重构及AngⅡ诱导的H9c2心肌细胞损伤的干预效应及可能机制，主要明确大川芎方对高血压大鼠心室肥大、心肌纤维化、氧化应激的异常是否具有防治作用，以及对心肌细胞NADPH/ROS/NF-κB信号通路异常活动的调控作用。
方法
选用12周龄雄性无特定病原体级(SPF级)SHR大鼠40只和Wistar-Kyoto(WKY)大鼠10只，随机分为:空白对照组(WKY组)、模型组(SHR组)、SHR+大川芎方高剂量组、SHR+大川芎方低剂量组、SHR+氨氯地平组。连续用药干预六周，1次/日。给予等体积的蒸馏水灌胃空白对照组以及模型组。干预前测量血压一次，干预开始后每周测量血压一次。干预六周后计算心肌肥厚指数(心脏质量/体重，即HW/BW)的值从而定量心肌肥厚的程度。HE染色法观察心肌形态结构变化；天狼星红染色法观察心肌纤维化程度；PCR检测心房利钠因子(ANF)和β-肌球蛋白重链(β-MHC)mRNA的表达；Western-blot检测NOX2、NF-κBp65、NOX4蛋白的表达。
体外培养H9c2细胞，采用AngⅡ(0.1mol/L)来诱导心肌细胞损伤模型。观察大川芎方含药血清对AngⅡ诱导的H9c2细胞损伤的影响。H9c2细胞的处理和分组为:空白对照组、空白血清组、含药血清组、AngⅡ组、AngⅡ＋空白血清组、AngⅡ＋含药血清组。CCK-8法检测H9c2细胞的活力；DHE荧光法检测ROS活性；PCR检测ANF和β-MHCmRNA的表达；Western-blot检测NOX2、NF-κBp65、NOX4蛋白的表达。
结果
第一部分：
1.大川芎方可降低SHR大鼠动脉血压。与WKY组相比，SHR组大鼠收缩压显著升高(P＜0.05)；与SHR组相比，三个治疗组6周治疗结束后血压均显著下降(P＜0.05)；与大川芎方低剂量组相比，大川芎方高剂量组和氨氯地平组效果更佳(P＜0.05)。说明一定剂量大川芎方可有效降低高血压大鼠的动脉血压。
2.大川芎方可降低高血压大鼠心肌肥厚指数。与WKY组比较，SHR组的HW/BW明显增大(P＜0.01)；与SHR组相比，各治疗组的HW/BW均有降低(P＜0.05)。说明大川芎方可显著抑制高血压大鼠的心室肌肥厚。
3.大川芎方可改善SHR大鼠左心室的心肌形态结构。HE染色结果显示：WKY组大鼠的心肌细胞排列不紊乱，形态规则，无肌纤维断裂或溶解现象，胞核均匀分布，没有发生变性坏死，没有炎性细胞浸润，无心室重构发生；SHR组心肌细胞及胞核横截面积变大，排列不规则，发生多处断裂或溶解，胞核大小不一，胞质嗜酸性增强，伴有大量炎细胞浸润，发生明显的心室重构。与SHR比较，SHR+大川芎方低浓度组大鼠心肌细胞存在不同程度肥大，发生心室重构；SHR+氨氯地平组、SHR+大川芎方高剂量组的病变程度较SHR组有所改善，有排列较为整齐的心肌细胞，没有明显肥大发生，炎性细胞少见。对各组大鼠的心肌细胞横截面积定量分析发现，与WKY组相比，SHR组心肌横截面积显著增大(P＜0.01)；与SHR组相比，治疗组能够降低心肌横截面积(P＜0.05)，其中SHR+大川芎方高剂量组和SHR+氨氯地平组效果更显著(P＜0.01)。提示一定剂量的大川芎方能够改善高血压大鼠的心肌肥大。
4.大川芎方可以改善SHR大鼠左心室的心肌纤维化。天狼星红染色显示：WKY组多为黄色为主的心肌纤维，心肌细胞间质及心肌血管周围有少量的红色胶原纤维，但是SHR组大鼠的心肌间质及其血管周围存在大量纵横交织的红色胶原纤维。和SHR组相比较，SHR+氨氯地平和SHR+高低剂量大川芎方处理后可以明显改善心肌组织胶原蛋白的沉积。对心室肌组织切片的血管周边胶原容积分数分析发现，各治疗组较SHR组心肌纤维化程度有所改善(P＜0.05)，其中SHR+大川芎方高剂量组和SHR+氨氯地平组效果最为显著(P＜0.01)。表明一定剂量的大川芎方可以改善高血压大鼠的心肌纤维化。
5.大川芎方可以抑制SHR大鼠心肌肥大标志性基因ANF，β-MHCmRNA表达。结果显示，与WKY组相比较，SHR组心肌组织中ANF，β-MHCmRNA表达明显增高(P＜0.01)；各治疗组与SHR组组比较，mRNA水平明显降低(P＜0.01)；SHR+大川芎方高剂量组、SHR+氨氯地平组与SHR+大川芎方低剂量组比较明显降低(P＜0.01)。说明大川芎方能够降低心肌组织中ANF，β-MHCmRNA表达。
6.大川芎方可以降低SHR大鼠心肌组织NOX2、NOX4蛋白水平表达，并抑制NF-κBp65核转移。与WKY组相比，SHR大鼠心肌组织的NOX2、NOX4及胞核中NF-κBp65的蛋白表达水平均明显增加(P＜0.01)；与SHR组相比，各治疗组蛋白表达水平明显下降(P＜0.01)，且SHR+大川芎方高剂量组蛋白表达效果最佳。与WKY组相比，SHR大鼠心肌组织胞浆中NF-κBp65的蛋白表达水平明显降低(P＜0.01)；各治疗组蛋白表达水平明显升高(与SHR组相比)(P＜0.01)，且SHR+大川芎方高剂量蛋白表达效果最佳。表明大川芎方能够降低NOX2、NOX4蛋白水平，并可抑制NF-κBp65发生核转移。
第二部分：
1.大川芎方含药血清对H9c2细胞的影响。结果显示，不同浓度(10%，15%，20%， 25%，30%)大川芎方含药血清对H9c2细胞活力的影响没有显著性差异(P＞0.05)。说明大川芎方含药血清对心肌细胞无明显毒性作用。
2.大川芎方含药血清对H9c2细胞活力的影响。各组心肌细胞与相应干预措施作用48h后，结果显示，AngⅡ组细胞活力显著低于空白对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)；AngⅡ+25%含药血清组及AngⅡ+30%含药血清组细胞活力明显高于AngⅡ组，差异有统计学意义(P＜0.05)，25%含药血清差异显著(P＜0.01)。取浓度为25%的含药血清作为后续实验条件。
3.大川芎方含药血清可抑制AngⅡ诱导的ROS生成。结果显示：与空白组相比，AngⅡ刺激心肌细胞24h后，细胞内的红色荧光强度显著增强，可以说明ROS的生成增多。用25%大川芎方含药血清处理经AngⅡ刺激24h后心肌细胞，细胞内的红色荧光强度减弱，接近正常水平，表明大川芎方含药血清可抑制AngⅡ诱导的ROS的生成。
4.大川芎方含药血清对AngⅡ诱导的心肌肥大标志性基因ANF和β-MHCmRNA表达的影响。结果显示，与空白组相比较的情况下，AngⅡ组的心肌细胞肥大标志性基因ANF和β-MHCmRNA的表达量明显增高，具有显著性差异(P＜0.01)。25%空白血清组、25%含药血清组与空白组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。与AngⅡ组相比，AngⅡ+25%含药血清组心肌细胞ANP和β-MHCmRNA表达水平显著降低，差异具有统计学意义(P＜0.01)。
5.大川芎方含药血清可以降低AngⅡ诱导的H9c2细胞NOX2、NOX、NF-κBp65蛋白水平表达。结果表明，与空白组相比，AngⅡ组中心肌组织NOX2、NOX4及胞核中NF-κBp65的蛋白表达水平明显增加(P＜0.01)；25%空白血清组、25%含药血清组与空白组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)；与AngⅡ组相比，AngⅡ+25%大川芎方含药血清组心肌细胞NOX2、NOX4及胞核中NF-κB的蛋白表达水平明显下降(P＜0.01)。与空白组相比，AngⅡ组胞浆中NF-κBp65的蛋白表达水平明显降低(P＜0.01)；25%空白血清组、25%含药血清组与空白组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)；与AngⅡ组相比，AngⅡ+25%大川芎方含药血清组心肌细胞胞浆中NF-κBp65的蛋白表达水平明显升高(P＜0.01)。说明大川芎方含药血清可以降低NOX2，NOX4的蛋白水平，还能抑制NF-κBp65发生核转移。
结论
1大川芎方可改善高血压模型的左心室心肌肥厚、心肌纤维化和超氧化物的产生。
2.大川芎方可能通过NADPH/ROS/NF-κB信号通路来抑制氧化应激和炎症反应从而改善高血压心室重构。