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目的建立可靠、纯度高的犬骨髓基质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)的分离纯化方法,观察其在体外扩增、成骨分化的能力。并进一步探索和评估：(1)长期冻存后的BMSCs的成骨分化能力；(2)同种异体BMSCs修复颅骨标准骨缺损的能力；(3)同种异体BMSCs移植是否引起明显的免疫排斥反应。旨在建立随用随取的同种异体BMSCs库,解决骨组织工程种子细胞的来源问题,促进骨组织工程早日在临床上广泛应用。方法采用1.077g／mlFicoll分离液,密度梯度离心法分离Beagle犬骨髓得到BMSCs,体外培养、扩增并用成骨条件培养液进行成骨诱导,进行碱性磷酸酶、茜素红染色和OPN、OCN、Ⅰ型胶原免疫细胞化学或免疫荧光染色。将大量扩增且成骨诱导后的BMSCs在液氮中冷冻保存6个月,复苏后接种于β-TCP支架上共培养,构建BMSCs／TCP复合物。在10只平均体重为11.9kg的成年Beagle犬颅骨上分别制造左右两个直径为20mm的标准骨缺损,分别为实验侧和对照侧。实验动物共分为三组,分别为同种异体组、自体组和空白组。同种异体组接种的同种异体BMSCs来自于自体组的2只Beagle犬骨髓。自体组接种的BMSCs来自于自体组的2只Beagle犬各自本身,即为相同来源的BMSCs,其分离、纯化、成骨诱导后冻存、复苏、共培养及移植的方法在各组之间完全一致。其中6只为同种异体组,实验侧(左)应用成骨诱导后的同种异体BMSCs／β-TCP复合物修复,对照侧(右)单独应用β-TCP修复。另外2只犬(提供骨髓犬)为自体组,实验侧(左)应用成骨诱导后的自体BMSCs／β-TCP复合物修复,对照侧(右)单独应用β-TCP修复。其余2只犬为空白组,实验侧(左)单独应用β-TCP修复,对照侧(右)为空白对照,不接种任何材料。应用1-0号丝线封闭切口。采用组织学和影像学方法评估术后16和24周的修复情况。同时监测外周血T淋巴细胞亚群CD4+／CD8+的变化,对术后全身免疫反应进行评估。结果采用1.077g／mlFicoll液可获得纯度较高的BMSCs,细胞生长良好,平均倍增时间为24h,经成骨诱导培养后可定向分化为成骨细胞。应用成骨诱导后的冻存半年的同种异体BMSCs复合β-TCP修复Beagle犬颅骨标准骨缺损,无明显不良反应,所有动物术后均存活,无感染发生。16周后初步的组织学和影像学检查表明,同种异体组(6例)的成骨情况良好。免疫学分析表明CD4+和CD8+T细胞数量以及CD4+／CD8+比值在三组Beagle犬中无显著性差异(p>0.05)。结论采用1.077g／mlFicoll液能有效地分离Beagle犬骨髓中的BMSCs,通过成骨诱导可分化为成骨细胞,从而为骨缺损的修复提供理想的组织工程种子细胞。长期冻存的同种异体BMSCs复苏后与β-TCP支架共培养,植入Beagle犬颅骨标准骨缺损中,在没有使用免疫抑制的情况下可以很好的修复骨缺损,没有明显的免疫排斥反应发生。