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烟草是一种重要的叶用经济作物,在烟叶种植过程中易出现早花现象,烟草早花严重影响烟叶产量和质量。低温是诱导烟草早花的重要因素之一,到目前为止,其相关的早花规律研究结果意见不一,其分子机制也一直不清楚。本研究利用低温敏感的烤烟品种NC82,通过不同苗期的低温诱导处理(12℃10 d ),研究该品种在不同苗期对低温的敏感特性;与此同时,采用RT-PCR和RACE等同源克隆技术对NC82中与开花相关的MADS-box家族基因进行同源克隆,并采用半定量RT-PCR和Real-Time PCR技术对克隆得到的基因进行表达分析。该研究具有现实的生产指导意义,也为培育低温不敏感烤烟品种提供很好的功能基因。具体研究结果如下:(1)NC82的低温诱导结果:移栽后第16 d,8叶期低温处理的烟苗首先出现花芽分化迹象,开始由营养生长向生殖生长转变;移栽后第21 d,6叶期和8叶期低温处理的烟苗均出现花芽分化,其对照均在移栽后第26 d左右才出现花芽分化,低温处理分别使其花芽分化提前5 d和8 d;移栽后第31d,6叶期和8叶期低温处理的烟苗提前现蕾,其对照在移栽第36 d左右才现蕾;低温处理和对照烟苗的中心花开放时间相差2～3 d,均在移栽后的第45～49 d; 4叶期低温处理的烟苗则相反,其花芽分化、现蕾和中心花开放分别比对照晚11d、18 d和16 d。所以6叶期和8叶期是NC82低温敏感期,低温能促进早花,但4叶期易受低温伤害,延迟开花;低温处理烟苗的花芽分化到现蕾时间比对照时间长,说明低温延长了花原基的分化过程;而现蕾到开花的天数波动很大,可能受环境影响很大。(2)烟草MADS-box基因家族中间片段克隆:通过设计简并引物,采用RT-PCR技术从NC82茎尖中成功分离出27条cDNA片段,长度在122～146 bp之间。序列分析表明,其中有16条具有MADS_MEF2类保守结构域,与拟南芥等MADS-box基因家族成员具有很高的同源性,相似性平均能达到76%,并具有15个保守的氨基酸位点,其中7个位点参与蛋白与DNA的相互作用,5个位点具有蛋白二聚化功能。系统发育分析发现这16条保守片段分别和拟南芥9个不同的MADS-box基因家族亚类最近似,其中FLC、STMADS11、TM3和AGL6亚家族具有控制开花时间的功能;AG、AGL2和DEF/GLO亚家族分别属于C/D型、E型和B型花器官同源异型基因;AGL15和AGL12亚家族的基因在茎中也可以表达。(3)烟草NtFLC的全长克隆及表达分析:利用与拟南芥AtFLC相似性最高的中间片段LyE05设计引物进行3’RACE和5’全长克隆,选取5’完整的片段A5(805 bp)和B1(433 bp),3’RACE的845 bp全长,以及中间保守序列LyE05 (146 bp)进行烟草FLC类基因的全长拼接,得到1174 bp的烟草FLC类全长cDNA。应用NCBI的ORF finder软件,发现其可读框架(ORF)位于172～786位核酸之间,长度615 bp,编码204个氨基酸,该蛋白属于MADS-box基因家族,并含有保守的MADS-box和K-box结构域;系统发育树分析发现其与拟南芥AtFLC具有同源性;半定量RT-PCR的表达分析发现NtFLC主要在茎和茎尖中表达,在花和果实中表达量很少;Real-Time PCR进行准确定量分析表明NtFLC的表达量在低温处理后的茎尖中是降低的。所以推测NtFLC可能与NC82低温敏感,易早花特性相关,在烟草中具有与拟南芥AtFLC相近的功能。