背景和目的鼻咽癌是我国华南地区高发的恶性肿瘤之一。鼻咽癌病因学研究表明:EB病毒感染和环境因素（促癌物和/或致癌物,如TPA、丁酸、亚硝胺类等）在致癌过程中均可能起十分重要的作用。但是,迄今为止,鼻咽癌病因尚未明确,发病机制亦不十分清楚,这给NPC一级预防（病因预防）带来极大困难。因此,继续探索鼻咽癌病因和发病机制仍具有重要意义和现实紧迫性。目前,NPC主要治疗手段是放疗。随着适型调强放疗技术的推广,NPC患者局部控制率得到显著改善,但仍有20-30%的中晚期NPC患者在五年内发生复发与远处转移。复发和远处转移是NPC治疗失败的主要原因。因此,寻找新型NPC治疗靶点,减少复发和远处转移,对提高NPC治疗效果有着十分重要的意义。肿瘤干细胞（Cancer stem cells,CSCs）是存在于肿瘤组织中的一小群具有干细胞特性的细胞亚群。CSCs具有如下重要生物学特性:（1）自我更新;（2）分化潜能;（3）生存于特定微环境中;（4）高致瘤性;（5）耐放化疗等。CSCs是肿瘤发生的根源,是肿瘤增殖、复发、转移与耐治疗的根本,而肿瘤复发和转移是导致肿瘤患者死亡的最主要原因。因此,为获得理想抗癌疗效,有效清除CSCs是十分关键的。新型靶向CSCs的抗癌治疗策略,为治愈癌症带来了新希望,但癌症靶向CSCs治疗研究走入临床依然任重道远。肿瘤转移是导致癌症患者死亡的首要因素,但目前对肿瘤转移的分子机制还知之甚少。解析肿瘤转移的分子机制,建立相应的阻断肿瘤转移的途径,是迫切需要解决的重要问题之一,是治愈肿瘤的希望所在。肿瘤转移是一个连续、渐进的多阶段、多步骤、多因子参与的复杂演变过程,其中上皮-间充质转化（Epithelial-mesenchymal transitions,EMT）是上皮细胞来源的肿瘤发生转移初期必经的关键阶段和事件。迄今对肿瘤细胞EMT发生的分子机制还知之甚少,因而目前针对肿瘤转移中EMT机制的研究备受关注,相关机制的阐明对恶性肿瘤侵袭转移前的早期诊断、早期治疗有着非常重要的意义。miRNA是一类非编码的小分子RNA,其通过一定方式可参与有机体多种生理和病理过程。本课题组前期研究发现,miR-9靶向下调CCNG1抑制NPC细胞增殖;并且miR-9参与抑制了 NPC CSCs的自我更新。本课题组研究证实,Hes1是miR-9的靶基因,Hes1可能介导了 miR-9抑制NPC CSCs自我更新的功能。Hes1（hairy and enhancer of split-1）基因编码转录因子Hes1,属于果蝇属发状基因在哺乳类动物的同系物。Hes1是Hes（HES1-7）基因家族的七个成员之一。Hes基因编码核蛋白抑制转录。Hes属于转录因子的碱性螺旋-突环-螺旋（b-HLH）家族,它是一个转录抑制子,通过bHLH起作用。HES包括三个保守结构域:bHLH,橙色结构域和WRPW模序。Hes基因区别于其他bHLH转录因子是在碱性DNA结合功能域拥有一个脯氨酸。这个脯氨酸使Hes蛋白有了结合单一 DNA分子的能力。大多数bHLH结合增强子区的保守序列（CAN-NTG）,但Hes更倾向于结合靶基因的C类位点或N-框（CACNAG）。橙色结构域主要功能是为bHLH异源二聚体选择配体,而C端的WRPW序列是抑制转录。文献报道,Hes1/Hes5基因可通过下调Hash1表达抑制细胞分化,促进宫颈癌细胞增殖。而在乳腺癌细胞中表达Hes1可抑制雌激素所刺激的细胞增殖以及雌激素所诱导的细胞周期调控因子E2F-1的表达。Hes1与成体干细胞和CSCs有着密切关系。研究表明,Hes1是成体干细胞（如造血干细胞、小肠干细胞、黑色素干细胞、胰腺干细胞等）自我更新与增殖、干性维持、存活或/和抑制干细胞分化等所必需的,常被用作干细胞标志物。miR-199b下调其靶基因Hes1表达清除了髓母细胞瘤中的CSCs。TNFα通过激活Notch-Hes1增加口腔鳞状细胞癌细胞中CSCs含量。Hes1在结肠癌的发展和演进中起着重要作用并且维持结肠癌CSCs的干性。Hes1与NPC CSCs的关系的研究报道指出,Hes1与Oct4和Sox2于NPC细胞上共表达。本课题组前期研究发现,通过RNA干扰下调NPC细胞中Hes1表达,会导致NPC细胞中干性相关基因表达下调。根据如上信息和我们的前期研究结果,我们推测,Hes1亦有可能参与NPC CSCs生物学特性（如自我更新等）的调控。但仍需实验进一步确证。本课题在此研究基础上,对Hes1在鼻咽癌细胞和组织中的表达特性进行了鉴定,进一步通过改变Hes1的表达水平观察其对于鼻咽癌细胞生物学特性的影响,并探讨其可能的作用机制及调控网络,从而为深入理解鼻咽癌发病的分子机制和确定新的分子靶向治疗靶标奠定基础。方法1.Hes1在鼻咽癌细胞株和临床组织标本中的表达谱1)应用qRT-PCR和Western blot方法从mRNA水平和蛋白水平检测鼻咽癌细胞株 CNE1、CNE2、HNE1、SUNE1、HONE1、5-8F、6-10B、C666-1 和永生化鼻咽上皮细胞NP69中Hes1的表达水平。2)应用免疫组化方法检测29例非癌鼻咽上皮组织和103例NPC组织中Hes1的表达水平,并分析其与临床病理特征之间的关系。2.Hes1对鼻咽癌细胞增殖及肿瘤干细胞的调控作用及其机制1)建立稳定过表达和干扰细胞株质粒抽提试剂盒提取质粒后,NaAC、乙醇沉淀法纯化质粒。包装载体PMD2G和穿梭载体PsPAX2与目的质粒、lipotemin2000共转染至293T细胞,得到的病毒上清以浓度梯度方式感染细胞,嘌呤霉素2 μg/ml作用约2周杀死未感染细胞,或者流式细胞仪分选出成功感染的细胞,以建立稳定过表达或干扰的鼻咽癌细胞株。以空载体同时进行病毒包装及感染鼻咽癌CNE2和SUNE1细胞,获得对照。应用qRT-PCR和Western blot方法对已构建的稳定细胞株的基因水平进行鉴定。2)应用CCK-8和平板克隆形成实验检测Hes1基因对NPC细胞生长和增殖的影响。3)流式细胞仪检测细胞周期。4)应用Western b1ot方法检测细胞中干细胞相关标志基因的表达水平。5)肿瘤球培养和SP细胞比例检测评估Hes1基因对NPC CSCs的影响。6).裸鼠皮下移植瘤实验观察细胞在体内的成瘤能力。7)免疫组化检测裸鼠移植瘤组织标本及人NPC组织标本中Hes1与增殖和干细胞相关标志基因的表达相关性。8)定量ChIP实验检测Hes1与PTEN启动子位点的结合情况。9)建立稳定过表达和干扰PTEN、Hes1/PTEN的细胞株进行回复实验。3.Hes1对鼻咽癌细胞EMT、侵袭和转移的调控作用及其机制研究1)应用qRT-PCR和Western blot方法检测细胞中EMT相关基因的表达水平。2)应用Transwell和Boyden小室检测细胞的体外迁移和侵袭能力。3)裸鼠肝包膜移植实验评估Hes1对CNE2细胞体内转移能力的影响。4)进行功能回复实验以探讨Hes1对鼻咽癌细胞EMT、侵袭和转移作用的调控机制。5)免疫组化检测人NPC组织标本中Hes1与EMT相关标志基因的表达相关性。结果1.Hes1在鼻咽癌细胞株和临床组织标本中的表达谱1)Hes1在NPC细胞株中的表达应用qRT-PCR检测NPC细胞株和永生化鼻咽上皮细胞NP69中Hes1的表达情况。经Welch近似方差分析,显示各细胞株中Hesl的表达有差异（F=48.630,P=0.000）。经用Dunnett T3方法对各组间进行多重比较,结果显示,SUNE1和5-8F中Hes1的表达水平较NP69高（P<0.05）,而低转移高分化鳞状细胞癌细胞系6-10B中Hes1的表达水平较NP69低（P<0.05）。Western blot结果显示,鼻咽癌细胞株CNE1、CNE2、HNE1、SUNE1中Hes1表达量较NP69高,6-10B中Hes1表达量较NP69低,而在C666-1中的表达未见明显增高。2)免疫组化检测慢性鼻咽炎组织和鼻咽癌组织中Hes1的表达免疫组化检测29例非癌鼻咽上皮组织和103例NPC组织中Hes1的表达水平,结果示,29例非癌鼻咽上皮组织中有19例（65.5%）Hes1低表达,10例（34.5%）高表达;而103例鼻咽癌组织中有44例（42.7%）Hes1低表达,59例（57.3%）高表达。与非癌鼻咽组织相比,Hes1在鼻咽癌组织中显著高表达（χ2=4.715,p=0.030）。3)Hes1蛋白表达与临床病理资料的关系经统计分析,Hes1蛋白的表达在鼻咽癌患者的性别（P=0.882）、年龄（P=0.162）、组织学分型（P=0.079）以及肿瘤复发与否（P=0.718）组别间,差异无统计学意义。而Hes1蛋白的表达与肿瘤T分期（P=0.018）、颈部淋巴结转移（P=0.006）、远处转移（P=0.021）以及临床分期（P=0.010）有显著关联。T分期中T3-T4期组高于T1-T2期组,N分期中N2-N3组表达高于N0-N1组,有远处转移组中Hes1的表达高于未转移组,临床分期Ⅲ-Ⅳ期患者高于Ⅰ-Ⅱ期组。4)Hes1的表达对鼻咽癌患者生存期的影响单因素分析表明,鼻咽癌患者Hes1高表达组的总体生存率明显低于低表达组（P=0.003）。此外,淋巴结转移（P=0.019）、远处转移（P=0.000）、临床分期（P=0.010）以及肿瘤复发与否（P=0.000）也对患者的总生存率有影响。而性别、年龄、组织学分型和T分期等临床病理参数对患者生存率的影响均无统计学意义（P>0.05）。Cox多因素回归分析表明,远处转移（P=0.011）和肿瘤复发与否（P=0.000）是影响患者生存和预后的一个重要的独立因素,但对Hes1的表达是否作为影响患者生存和预后的独立因素进行分析,P=0.053,不具有统计学意义。2.Hes1对鼻咽癌细胞增殖及肿瘤干细胞自我更新的调控作用及其机制1)建立稳定过表达及干扰Hes1的细胞株分别将Hes1慢病毒质粒pWPXL-Hes1及其空载质粒,以及Hes1 shRNA慢病毒质粒及其空载质粒（pCSⅡ）,与包装质粒PMD2G和PsPAX2共转染至293T细胞,产生4种病毒,即过表达Hes1（LV-Hes1）的病毒和空载对照（LV-con）病毒,以及干扰Hes1的病毒（LV-shHes1）和相应空载对照病毒（LV-shSCR）。转染72h后,收病毒上清感染NPC细胞CNE2和SUNE1。用荧光定量PCR鉴定建立的稳定细胞株中Hes1的表达情况,结果示,过表达Hes1的CNE2（t=8.965,P=0.001）和SUNE1细胞（t=21.017,P=0.000）较对照细胞Hes1表达升高,干扰Hes1的CNE2（t=-10.756,P=0.000）和SUNE1 细胞（t=-13.287,P=0.000）较对照细胞Hes1表达降低,差异具有统计学意义。Western blot结果与荧光定量检测结果一致。2)Hes1促进NPC细胞体外生长和增殖用CCK-8法检测细胞生长曲线,结果示,在CNE2（F=97.234,P=0.000）和SUNE1细胞（F=29.590,P=0.000）中过表达Hes1细胞组较空载对照组生长加快,而干扰 Hes1 的 CNE2（F=48.112,P=0.000）和 SUNE1 细胞（F=27.193,P=0.000）较对照组生长减慢。平板克隆形成实验示,在CNE2（t=11.533,P=0.000）和SUNE1细胞（t=5.859,P=0.004）中过表达Hes1细胞组较空载对照组克隆形成数目增多,而干扰Hes1 的 CNE2（t=-9.717,P=0.001）和 SUNE1 细胞（t=-4.990,P=0.008）组较对照组克隆数减少。以上两个实验结果均表明,Hes1促进鼻咽癌细胞体外生长和增殖。3)Hes1影响NPC细胞周期分布采用流式细胞术分析过表达及干扰Hes1后细胞周期分布,结果发现,与空载对照细胞相比,过表达Hes1的CNE2（t=6.713,P=0.003）和SUNE1细胞株（t=5.889,P=0.004）S 期细胞比例升高,而干扰Hes1 的 CNE2（t=-6.042,P=0.004）和SUNE1细胞株（t=-2.821,P=0.048）S期比例下降。4)Hes1对鼻咽癌肿瘤干细胞的影响应用Western blot检测各组细胞中干细胞相关标志基因的表达,结果显示,与空载对照细胞相比,过表达细胞株（CNE2/LV-Hes1、SUNE1/LV-Hes1）中干细胞相关标志基因ABCG2和Nanog表达升高,而干扰细胞株（CNE2/LV-shHes1、SUNE1/LV-shHes1）中ABCG2和Nanog表达下降。肿瘤球培养实验结果显示,过表达 Hes1 的 CNE2（t=12.559,P=0.000）和 SUNE1（t=15.336,P=0.000）细胞较空载对照细胞成球数增加,而干扰Hes1的CNE2（t=-18.601,P=0.000）和SUNE1（t=-21.870,P=0.000）细胞株形成肿瘤球的数目较对照组减少。流式细胞仪检测各组细胞中SP细胞含量,结果显示,在CNE2（t=30.559,P=0.000）和SUNE1细胞（t=16.286,P=0.000）中过表达Hes1细胞组较空载对照组SP细胞比例增多,而干扰Hes1的CNE2（t=-6.030,P=0.024）和SUNE1细胞组（t=-32.199,P=0.000）较对照组SP细胞比例下降。5)Hes1促进鼻咽癌CNE2细胞体内成瘤裸鼠背部左右两侧分别皮下移植CNE2/LV-con和CNE2/LV-Hes1细胞,移植剂量分别为 1.0×106（n=6）、1.0×105（n=8）、1.0×104（n=10）及 1.0×103（n=10）。结果显示,移植CNE2/LV-Hes1细胞组裸鼠皮下肿瘤体积显著大于对照组。此外,在移植高剂量细胞（1×106）时,两组裸鼠均全部成瘤;而当移植细胞数减少后（1×105、1×104及 1×103）,LV-Hes1 组有 76.5%（26/34）形成肿瘤,而对照组仅有38.2%（13/34）形成肿瘤。此外,在1×1 03个细胞注射后,在LV-Hes1组第一个肿瘤出现于第16天,而对照组则在第34天才出现肿瘤。取瘤组织固定包埋后行HE染色,及免疫组化检测两组组织中Hes1、BrdU、Ki-67和P21的表达水平。结果显示,LV-Hes1组组织中Hes1、BrdU、Ki-67阳性染色细胞均高于对照组,P21阳性显色细胞低于对照组（图2-7C）。结果表明,Hes1基因导入CNE2细胞后,能显著促进细胞裸鼠体内成瘤。6)免疫组化检测103例鼻咽癌组织中Hes1与CSCs相关分子蛋白的关系对103例鼻咽癌组织行免疫组化检测Hes1与CSCs相关分子蛋白ALDH1、Sox2、Oct4、Nanog的表达,结果发现,在高表达Hes1的NPC组织中,也高表达ALDH1、Oct4、Nanog（均P<0.05）,具有显著性意义。7)PTEN是Hes1的靶向抑制基因。我们检测了过表达及干扰Hes1的NPC细胞中PTEN的表达,qRT-PCR及Western blot 结果均显示,在过表达Hes1 的 CNE2（t=-17.195,P=0.000）和 SUNE1细胞（t=-26.532,P=0.000）中PTEN表达下调,反之,在干扰Hes1的CNE2（t=3.529,P=0.024）和 SUNE1 细胞株（t=5.174,P=0.007）中 PTEN 表达升高。我们随后进行了 ChIP实验对这一靶向结果予以确证,PTEN启动子序列为（-2000bp+1032bp）,以Hes1作为靶蛋白,根据文献报道及软件分析,预测其与 PTEN 基因启动子的结合位点为:A:-1492bp-1343bp;B:-1186bp-1085bp;C:-385bp-286bp;D:+119bp+278bp。荧光定量 PCR 检测 ChIP 产物,结果显示,Hes1在PTEN启动子的A、B、C、D位点均有结合（均P<0.05）。以上结果表明,Hes1通过与PTEN启动子位点结合,靶向抑制PTEN。8)Hes 1通过靶向抑制PTEN激活PTEN/AKT信号通路,从而促进NPC CSCs的增加。已有文献报道PTEN/AKT信号通路在肿瘤干细胞调节中发挥重要作用,为明确Hes1对NPC CSCs的调节作用是否由PTEN介导激活这一信号通路,我们首先分别构建了以下稳定细胞株:过表达PTEN的CNE2细胞（LV-PTEN）、干扰PTEN的CNE2细胞（LV-shPTEN）、过表达Hes1后再过表达PTEN的CNE2细胞（LV-Hes1+LV-PTEN）、干扰Hes1后再干扰PTEN的CNE2细胞（LV-shHes1+LV-shPTEN）。以及收集分别由AKT抑制剂LY294002作用24h后的 CNE2/LV-Hes1 细胞（LV-Hes1+LY294002）和 CNE2 细胞（LY294002）,用于后续实验。我们用Western blot检测了各细胞株中PTEN/AKT信号通路基因及干性相关基因的表达。结果显示,在CNE2细胞中过表达Hes1后,p-AKT和干细胞标志基因（ABCG2和Nanog）的表达上调,这与在CNE2细胞中干扰PTEN引起的效应一致。而在过表达Hes1的CNE2细胞中再过表达PTEN或者用LY294002（AKT抑制剂）处理,又可以部分或完全逆转由Hes1过表达引起的基因改变。同样,在CNE2细胞中干扰Hes1引起p-AKT以及干细胞标志基因ANCG2和Nanog表达下调,这与在CNE2细胞中过表达PTEN引起的改变一致。而在干扰Hes1的CNE2细胞中再干扰PTEN,又可以部分抵消由Hes1干扰引起的基因改变。肿瘤球形成实验结果显示,各组细胞形成肿瘤球的数目差异具有统计学意义（F=87.519,P=0.000）。其中,LV-shPTEN组与LV-Hes1组相比形成肿瘤球数目无差别（P=0.406）,均多于对照LV-con组（P=0.000;P=0.000）;而在CNE2/LV-Hes1细胞中过表达PTEN,或者经由AKT抑制剂LY294002处理后,均可以回复Hes1对CNE2细胞肿瘤球形成能力的调节作用。接下来我们用流式细胞仪检测了上述细胞株中SP细胞的比例,经We1ch近似方差分析,显示各组SP细胞比例均有差异（F=574.075,P=0.000）。经用Dunnett T3方法对各组间进行多重比较,结果显示,LV-shPTEN组与LV-Hes1组SP比例均多于对照LV-con组（P<0.05）;LV-PTEN组与LV-shHES1组SP比例均少于对照LV-shSCR组（P<0.05）。此外,由LY294002作用后的CNE2细胞和CNE2/LV-Hes1细胞中SP比例显著下调（P<0.05）。而LV-Hes1+LV-PTEN组与LV-con 组比较（P>0.05）,LV-shHes1+LV-shPTEN 组与 LV-shSCR 组比较（P>0.05）,SP比例均无差别。即,在CNE2细胞中过表达Hes1后再过表达PTEN,或者干扰Hes1后再干扰PTEN,均可以回复Hes1对CNE2细胞中SP细胞比例的调节作用。以上结果表明,Hes1通过靶向抑制PTEN激活PTEN/AKT信号通路,从而促进NPC CSCs的增加。3.Hes1对鼻咽癌细胞EMT、侵袭和转移的调控作用及其机制1)Hes1调节NPC细胞株中EMT相关基因的表达应用qRT-PCR检测EMT相关基因的表达,发现在Hes1过表达的鼻咽癌CNE2和SUNE1细胞株中,与上皮相关的基因E-cadherin（t=-42.176、-17.327,P=0.000、0.000）和β-catenin（t=-9.098、-8.633,P=0.010、0.001）表达下降,而与间充质相关的基因 N-cadherin（t=7.316、3.568,P=0.002、0.023）和 Vimentin（t=2.162、22.858,P=0.047、0.000）则表达升高。而在干扰 Hes1 的 CNE2 和SUNE1中,这些EMT相关基因的改变则相反,即E-cadherin（t=13.857、6.611,P=0.000、0.020）和β-catenin（t=36.864、7.410,P=0.000、0.017）表达升高,而N-cadherin（t=-11.904、-10.657,P=0.000、0.000）和 Vimentin（t=-6.564、-4.616,P=0.003、0.037）表达下降。Western blot结果与qRT-PCR结果一致,在过表达Hes1的CNE2和SUNE1细胞中,与上皮相关的基因（E-cadherin、α-catenin、β-catenin）表达下降,而与间充质相关的基因（N-cadherin、Vimentin、Fibronectin）则表达升高。反之,在干扰Hes1的CNE2和SUNE1细胞中,上皮相关的基因（E-cadherin、α-catenin、β-catenin）表达升高,而与间充质相关的基因（N-cadherin、Vimentin、Fibronectin）则表达下降。以上结果均提示,Hes1调节NPC细胞株中EMT相关基因的表达,促进NPC细胞发生EMT样改变。2)Hes1促进NPC细胞体外迁移与侵袭Transwell迁移实验显示,过表达Hes1 的CNE2（t=4.106,P=0.003）和SUNE细胞（t=4.997,P=0.001）迁移细胞数较对照组增多,而干扰Hes1的CNE2（t=-10.733,P=0.000）和SUNE1 细胞株（t=-11.111,P=0.000）迁移细胞数较对照组减少。Boyden小室侵袭实验结果同样显示,与空载对照细胞株相比,过表达Hes1的CNE2（t=4.760,P=0.001）和SUNE1 细胞株（t=45.203,P=0.004）穿膜数增多,而干扰Hes1的CNE2（t=-11.027,P=0.000）和SUNE1细胞株穿膜（t=-20.574,P=0.000）数减少。以上结果表明,Hes1可以促进NPC细胞的体外迁移与侵袭能力。3)Hes1促进鼻咽癌CNE2细胞体内转移为进一步明确Hes1对鼻咽癌细胞体内转移能力的影响,我们将Hes1过表达的CNE2细胞（CNE2/LV-Hes1）及其对照细胞株（CNE2/LV-con）移植于裸鼠肝包膜下,移植剂量均为1×106/50μl/只,每组移植8只裸鼠,观察成瘤与转移情况。30天后取材,结果显示接种处全部成瘤。取肺组织,包埋固定行HE染色观察,发现CNE2/LV-Hes1组有7/8只发生肺转移,而对照组仅有3/8有肺转移结节。每只裸鼠计数10张连续切片肺转移结节数,结果显示,LV-Hes1组的肺转移结节数多于对照组（t=2.478,P=0.036）,差异具有显著性意义。结果表明,外源性表达Hes1可以促进鼻咽癌CNE2细胞裸鼠体内转移。4)Hes1通过靶向抑制PTEN激活PTEN/AKT/GSK3β/Snail信号通路,促进鼻咽癌EMT、侵袭和转移前述已证实PTEN为Hes1的靶基因,已有文献报道PTEN抑制激活的AKT/GSK3β通路是重要的参与EMT的信号通路。那么Hes1促进鼻咽癌细胞EMT、侵袭和转移的作用是否也是由PTEN/AKT/GSK3β信号通路介导的呢?为此,我们首先用Western blot检测了稳定过表达及干扰Hes1的CNE2和SUNE1细胞中PTEN、AKT、p-AKT、GSK3β、p-GSK3β蛋白的改变。结果显示,与空载对照细胞相比,过表达Hes1细胞株中PTEN表达下调,p-AKT、p-GSK3β表达上调;反之,干扰Hes1的细胞株中PTEN表达上调,p-AKT、p-GSK3β表达下调。接着进一步比较 CNE2/LV-shSCR、LV-shHes1、LV-PTEN、LV-shHes1+LV-shPTEN细胞中EMT相关基因的表达。结果发现,在CNE2细胞中干扰Hes1与过表达PTEN引起的p-AKT、p-GSK3β以及EMT相关基因的改变一致,即与LV-shSCR相比,p-AKT、p-GSK3β表达下调,上皮相关基因（E-cadherin、α-catenin）表达上调,而间充质相关基因（N-cadherin、Vimentin、Fibronectin、Snail）表达下调。而在干扰Hesl后再干扰PTEN的细胞株LV-shHes1+LV-shPTEN中,这些EMT相关基因的表达又回复到起始水平。结果表明,Hes1通过靶向抑制PTEN激活PTEN/AKT/GSK3β/Snail信号通路从而调节EMT相关基因改变。Transwell迁移实验和Boyden侵袭实验显示,LV-shPTEN组与LV-Hes1组迁移和侵袭穿膜数均多于对照LV-con组（P<0.05）;LV-PTEN组与LV-shHES1组穿膜数均少于对照LV-shSCR组（P<0.05）。而LV-Hes1+LV-PTEN组与LV-con组比较（P>0.05）,LV-shHes1+LV-shPTEN 组与 LV-shSCR 组比较（P>0.05）,穿膜数均无差别。即,在CNE2细胞中过表达Hes1后再过表达PTEN,或者干扰Hes1后再干扰PTEN,均可以恢复Hes1对CNE2细胞的侵袭和转移作用。结果表明,Hes1通过靶向抑制PTEN促进鼻咽癌细胞迁移和侵袭。综上,Hes1通过靶向抑制PTEN激活PTEN/AKT/GSK3β/Snail信号通路,从而促进鼻咽癌EMT、侵袭和转移。5)NPC组织中Hes1与EMT相关分子蛋白的关系对103例鼻咽癌组织标本行免疫组化检测Hes1与EMT相关分子蛋白E-cadherin、Fibronectin、Snail的表达,结果发现,在高表达Hes1的NPC组织中,E-cadherin（P=0.006）低表达,Fibronectin（P=0.000）和 Snail（P=0.001）高表达。进一步在组织标本中证实Hes1促进NPC EMT。结论1.Hes1在鼻咽癌组织中表达上调,并且与鼻咽癌演进及不良预后密切相关。2.Hes1促进NPC细胞体内外增殖,并且通过靶向抑制PTEN激活PTEN/AKT信号通路,促进NPC CSCs的增加。3.Hes1通过靶向抑制PTEN激活PTEN/AKT/GSK3β/Snail信号通路,促进鼻咽癌EMT、侵袭和转移。