【摘 要】
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目的:在受损组织的修复与再生过程中,快速且充足的血管供应为组织提供氧气、营养物质以满足局部代谢需求。外泌体作为间充质干细胞旁分泌的重要物质,在促进血管生成和组织再生中发挥重要作用。血管内皮细胞（vascular endothelial cells,VECs）不断增殖,迁移并排列成管状结构是血管生成的初始过程。其中,细胞迁移是影响血管生成过程中管腔形成的重要因素,也是新生血管生成的基础。细胞分裂周期
【基金项目】
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国家自然科学基金项目（编号82071100）:SCAP外泌体双重调控Cdc42驱动血管内皮细胞迁移介导口腔黏膜再生的机制研究,2021/01/01-2024/12/31；
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目的:在受损组织的修复与再生过程中,快速且充足的血管供应为组织提供氧气、营养物质以满足局部代谢需求。外泌体作为间充质干细胞旁分泌的重要物质,在促进血管生成和组织再生中发挥重要作用。血管内皮细胞（vascular endothelial cells,VECs）不断增殖,迁移并排列成管状结构是血管生成的初始过程。其中,细胞迁移是影响血管生成过程中管腔形成的重要因素,也是新生血管生成的基础。细胞分裂周期蛋白42（cell division cycle 42,Cdc42）调控丝状伪足形成,调节细胞骨架重组从而促进细胞迁移。芳香烃受体（aryl hydrocarbon receptor,AhR）是一种重要的受胞内配体激活的转录因子,在肿瘤组织细胞的增殖、凋亡、黏附和迁移等生物学行为中发挥重要调控作用,应用PROMO、LASAGNA和JASPAR数据库分析AhR可能是调节Cdc42的转录因子。本研究旨在探讨根尖牙乳头干细胞（stem cells from apical papilla,SCAP）来源的外泌体（exosomes derived from SCAP,SCAP-Exo）调控Cdc42转录介导VECs迁移的作用机制。研究方法:1.酶消化法分离提取SCAP,成脂、成骨诱导检测其多向分化能力,流式细胞术检测间充质干细胞表面标记物。超高速离心法提取SCAP-Exo,透射电镜观察其形态特征,纳米颗粒示踪技术分析粒径,Western blot检测外泌体特异性蛋白Alix、CD9和细胞内质网特异性蛋白Calnexin的表达。2.沉默VECs中的Cdc42,应用SCAP-Exo处理VECs,q RT-PCR检测SCAP-Exo处理后Cdc42的m RNA表达水平,Western blot和Pull-Down实验检测Cdc42的蛋白和活化水平;划痕实验和Transwell迁移实验检测SCAP-Exo对VECs迁移能力的影响;F-actin免疫荧光染色观察VECs细胞骨架的变化。3.应用SCAP-Exo处理VECs,Western blot检测VECs内AhR总蛋白及核浆蛋白表达水平,免疫荧光检测AhR的核浆分布水平。4.应用AhR核转位的特异性抑制剂CH-223191处理VECs,加入SCAP-Exo,q RT-PCR、Western blot实验检测VECs内Cdc42的基因和蛋白表达水平。实验数据采用SPSS 22.0软件进行统计学分析,两样本间均数比较采用t检验,P＜0.05为统计学上有显著性差异。结果:1.SCAP呈梭形,具有成骨和成脂分化能力;SCAP阳性表达间充质干细胞表面标记物CD73、CD90、CD105,不表达造血干细胞表面标记物CD31、CD34、CD45。透射电镜观察SCAP-Exo呈椭圆形双层膜杯状结构,粒径大小在30-150 nm之间,Western blot显示SCAP-Exo阳性表达Alix和CD9,不表达Calnexin。2.SCAP-Exo能够上调VECs中Cdc42的基因和蛋白表达水平,沉默VECs内Cdc42后加入SCAP-Exo能够恢复被抑制的Cdc42表达水平。SCAP-Exo能够通过升高VECs内Cdc42表达提高VECs迁移能力,且丝状伪足形成数量增多（P＜0.05）。3.SCAP-Exo对VECs内总AhR蛋白表达无影响,而下调细胞浆中AhR表达水平,上调细胞核中AhR表达水平;免疫荧光结果显示SCAP-Exo能够促进VECs内AhR转位至细胞核中聚集（P＜0.05）。4.CH-223191显著抑制了VECs细胞核中AhR的表达水平,VECs内Cdc42的基因和蛋白表达水平显著下调,SCAP-Exo中加入CH-223191后Cdc42的基因和蛋白表达水平下调（P＜0.01）。结论:SCAP-Exo可能通过激活VECs内AhR入核,促进Cdc42转录,进而上调Cdc42的蛋白表达水平,调控VECs的细胞骨架重组,促进丝状伪足的形成,从而增强VECs的迁移能力。
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