论文部分内容阅读
目的： 微滴数字PCR对于痕量核酸检测具有显著优势，该技术将待测样本分散至数以万计的油包水微滴内，每个微滴最多只包含一个核酸分子，PCR反应结束后逐个检测每个微滴的荧光信号并计数，即得到起始模板的准确拷贝数。由于微滴被油相包裹，微滴荧光信号的检测需专门仪器，不能采用常规的基于水相流动的检测系统进行检测。本文构建一种基于水包油包水（W/O/W）双乳相微滴的数字PCR，有望采用流式细胞仪进行检测。 方法： 本研究属于方法学研究。首先，自行设计制作微流控芯片，生成油包水微滴，考察优化常规微滴数字PCR体系。其次，重点建立考察双乳相微滴数字PCR体系，设计并制作两种用于生成双乳相微滴的微流控芯片；选择双乳相液滴生成效率最高的芯片；优化各相液流组成保证双乳相液滴在热循环过程中的稳定性；最终，采用荧光显微镜进行观察。 结果： 1.采用本实验室自制的微流控芯片，成功实现基于油包水型微滴的数字PCR操作，并以此检测PIK3CA E545K突变位点，所得阳性微滴和总微滴的比值符合理论值。 2.自制双层式的微流控芯片可高效生成大小均匀的W/O/W双乳相微滴。 3.得到两组满足双乳相微滴数字PCR要求的反应体系：BIO RAD Probe PCR mix+EvaGreen/BIO RAD Probe oil/1% Tween20体系和BIO RAD EvaGreen PCR mix/BIO RAD EvaGreen oil/5% P123体系均可稳定生成双乳相微滴并进行热循环。 4.向外水相加入甘油可有效保持双乳相微滴在生成和热循环过程中体积的稳定。 5.向外水相中添加合适浓度的Mg2+，可保证双乳相微滴内PCR反应的顺利进行，此时荧光显微镜观察到明显的阴阳性微滴的荧光信号强度区别，且阳性微滴与总微滴的比值与理论值一致，这证明本研究构建的双乳相微滴数字PCR反应体系确实可行。 结论： 本实验成功建立基于微流控芯片的双乳相微滴数字PCR体系。双乳相微滴可直接用流式细胞仪进行检测，一方面降低数字PCR的检测成本，同时还可充分利用流式细胞仪的多通道荧光检测系统，大大增加可同时检测的目标序列的数量，借助流式细胞仪的分选功能；另一方面，有望对符合要求的特定微滴进行分选，便于开展后续研究。