论文部分内容阅读
雄性特异性抗原（male-specific antigen）通常也称为雄性特异性弱组织相容性Y抗原（male-specific minor histocompatibility Y antigen），简称H-Y抗原，是一组雄性特异性基因的表达产物，Eichwald等在1955年首次发现，H-Y抗原在异性间组织移植的排斥反应和性别控制等方面的研究中具有重要的理论和实践意义。由于H-Y抗原的多克隆抗体的特异性不强，而采用杂交瘤方法制备单抗（mAb），操作繁琐，而且mAb的效价不能得到明显的提高，给抗H-Y抗体在性别控制方面的应用造成了很大困难，也限制了其应用，而噬菌体表面展示技术为上述问题的解决提供了可能。 本研究首次采用噬菌体抗体库技术制备H-Y抗原的Fab抗体，利用雄鼠脾细胞作为抗原免疫同系雌鼠，构建了表面表达Fab的鼠源性噬菌体抗体库，并初步筛选出与雄鼠脾细胞特异性结合的Fab噬菌体克隆。首先，取雄鼠脾细胞免疫6～7周龄雌性C57BL／6雌鼠，加强免疫10天后，通过精子细胞毒实验和ELISA实验检测H-Y抗血清，取免疫效果较好的雌鼠脾细胞，Trizol法提取细胞总RNA，合成cDNA第一条链，利用简并引物进行PCR反应，扩增出抗体的Fd基因和全长轻链基因，将轻链基因和重链Fd基因分别插入噬菌体表达载体pComb3，然后将重组噬质粒转化到大肠杆菌XL1-Blue中，分别构建成κ链基因库和抗体Fab段基因库，进行蓝白斑筛选，计算转化效率。通过PCR反应和双酶切反应鉴定抗体库的重组率，轻链、重链Fd段基因的重组率均为80％。抗体Fab段基因库经过辅助噬菌体VCSM13超感染，成功构建了鼠源性噬菌体Fab抗体库。经测定，噬菌体抗体库的库容和滴度分别为5.2×106和3.2×1011pfu／mL。利用雄鼠脾细胞对噬菌体抗体库进行3轮亲和富集及2轮雌鼠脾细胞吸附交替筛选，特异性噬菌体得到有效的富集。从筛选后的噬菌体抗体库感染的XL1-Blue培养菌落中随机挑取15个菌落，鉴定含Fab基因克隆的重组率约为60％。ELISA检测鼠源性噬菌体Fab抗体特异性，结果显示有9株能与雄鼠脾细胞特异性结合，具有较好的雄性特异性。经测序分析，E5克隆的重链、轻链可变区序列分别属于VH1和VκⅣ基因家族。 以上结果表明：本研究成功构建了针对血清学检测到雄性特异性抗原的鼠源性噬菌体抗体库，为进一步筛选高亲和力的噬菌体抗体、提高基因工程抗体的亲和力、高效表达可溶性Fab抗体等研究奠定了坚实的实验基础。