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心肺复苏(cardiopulmonary resuscitation,CPR)技术自上世纪六十年代发展到如今已经挽救了无数心跳骤停(Cardiac arrest)患者的生命,随着心肺复苏技术的推广应用,心跳骤停患者的生存率得到了显著的提升。然而,心跳骤停数分钟后脑损伤即开始,心肺复苏后的缺血再灌注(ischemia reperfusion,I/R)损伤进一步加重缺血脑区的结构损伤和功能障碍。因此很多心跳骤停的病人即使得到了有效的抢救,也会遗留有严重的神经功能障碍,为家庭和社会带来严重的心理和经济负担。所以对于CPR之后的脑复苏治疗是近年来许多科学家研究的重点,具有重要的社会意义和研究价值。目前,治疗性低温(Therapeutic hypothermia,TH)作为最有效的脑复苏手段,被临床广泛应用。大量的临床和基础研究显示,心肺复苏后的低温治疗可降低脑组织氧耗和能量代谢,减轻细胞酸中毒,减少活性氧生成和兴奋性氨基酸释放,减少了炎症因子的产生并影响多条凋亡相关的分子通路。死亡受体途径和线粒体途径是神经元凋亡的两条经典通路,近些年科学家又提出第三条诱发细胞凋亡的通路,即内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)途径。根据我们前期的研究发现,治疗性低温可减轻全脑缺血再灌注大鼠海马的内质网应激,并可降低神经细胞的凋亡率。然而单纯的治疗性低温对于大鼠的脑复苏作用是有限的,因此越来越多的研究者寻求药物联合的方法来提高脑复苏的疗效。目前已发现外源性补充H2S的在脑缺血再灌注损伤中可以减轻氧化应激损伤以及抗神经细胞凋亡的作用。因此本研究拟在大鼠全脑缺血再灌注损伤的模型上探讨单纯应用硫化氢对于海马内质网应激的影响及联合治疗性低温应用对于海马内质网应激的影响。第一部分硫化氢对心肺复苏后大鼠海马内质网应激的影响目的:评价硫化氢对心肺复苏后大鼠内质网应激的影响。方法:清洁级健康雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠96只,体重280～320 g,8～10周龄,采用随机数字表法分为4组(n=24):假手术组(Sham组)、硫化氢组(H2S组)、全脑缺血再灌注组(I/R组)和全脑缺血再灌注+硫化氢组(I/R+H2S组)。采用经食管心脏起搏诱发心跳骤停并行心肺复苏制备大鼠全脑缺血再灌注损伤模型。Sham组与H2S组不进行心跳骤停和心肺复苏。硫化氢供体NaHS的给药方案:于自主循环恢复即刻H2S组与I/R+H2S组腹腔注射0.5 mg/ml硫氢化钠2.5 mg/kg,Sham组与I/R组腹腔注射等量生理盐水。于再灌注24 h时取海马组织,采用Western blot法检测葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、转录因子C/EBP同源蛋白(CHOP)和Caspase-12的表达;于再灌注1 d、3 d和7 d时取海马组织,行HE染色,光镜下观察海马CA1区病理学结果;采用TUNEL染色检测海马CA1区细胞凋亡情况,计算细胞凋亡率。结果:Sham组与H2S组检验结果比较无统计学差异(P>0.05);与Sham组或H2S组比较,I/R组与I/R+H2S组GRP78、CHOP及Caspase-12表达上调,正常锥体细胞减少,细胞凋亡率增加(P<0.05);与I/R组比较,I/R+H2S组GRP78(0.30±0.01比0.22±0.01,P<0.05)、CHOP(1.02±0.01 比0.81±0.02,P<0.05)及Caspase-12(0.48±0.02比0.37±0.04,P<0.05)表达下调,正常锥体细胞增多,细胞凋亡率降低(1d,6.0±1.8 比 3.3±1.2,P>0.05;3 d,49.5±1.9 比 29.8±2.2,P<0.05;7 d,47.5±2.7 比 28.7±2.2,P<0.05)。结论:硫化氢减轻心肺复苏后大鼠海马细胞凋亡的机制与抑制内质网应激有关。第二部分治疗性低温联合硫化氢减轻心肺复苏后海马内质网应激目的:观察治疗性低温联合硫化氢对心肺复苏后海马内质网应激的影响。方法:清洁级健康雄性SD大鼠220只,8～10周龄,体重280～320 g,采用随机数字表法分为5组(n=44,1 d组12只,3 d组12只,7 d组20只):假手术组(Sham组)、全脑缺血再灌注组(I/R组)、硫化氢组(I/R+H2S组)、治疗性低温组(I/R+TH组)、硫化氢+治疗性低温组(I/R+H2S+TH组)。采用经食道心脏起搏法诱发心跳骤停并行心肺复苏制备大鼠全脑缺血再灌注损伤模型。取7d组的大鼠(20只)于再灌注1 d、3 d、7 d时行神经功能缺陷评分(Neurological Deficit Scores,NDS)并记录生存情况。每组取6只大鼠处死取海马组织,采用Western blot法检测葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、转录因子C/EBP同源蛋白(CHOP)和Caspase-12的表达;每组6只大鼠于再灌注1d、3d、7 d时取海马组织,行HE染色,光镜下观察海马CA1区病理学结果;采用TUNEL染色检测海马CA1区细胞凋亡情况,计算细胞凋亡率。结果:再灌注1d、3d和7 d时,与Sham组比较,其余各组的GRP78、CHOP和Caspase-12表达均显著升高;与I/R组比较,I/R+H2S组、I/R+TH组I/R+H2S+TH组GRP78、CHOP和Caspase-12表达降低,差异有统计学意义。尤以再灌注3d时最为明显,[GRP78:(1.11±0.10)比(0.67±0.09、0.66±0.08、0.48±0.04,均P<0.05);CHOP:(1.60±0.11)比(1.39±0.09、1.34±0.08、1.13±0.09),均 P<0.05;Caspase-12:(0.87 ±0.08)比(0.65 ±0.08、0.59±0.06、0.45 ±0.06),均P<0.05]。再灌注3d和7d时,与Sham组比较,均表现为海马CA1区病理损伤严重、细胞凋亡率升高、神经功能缺陷评分降低;与I/R组比较,I/R+H2S组、I/R+TH组I/R+H2S+TH组均表现为海马CA1区病理损伤减轻,细胞凋亡率明显降低,神经功能缺陷评分改善,差异有统计学意义。除Sham组外,各组再灌注3d、7 d的细胞凋亡率较1d明显增加,神经功能缺陷评分3d、7 d较1 d明显升高,I/R+H2S+TH组的细胞凋亡率最低,神经功能缺陷评分改善最为明显;I/R+H2S+TH组7天生存率较I/R组、I/R+H2S组、I/R+TH组明显改善,差异具有统计学意义。治疗性低温、硫化氢单独或联合应用可显著改善内质网应激反应,减轻病理损伤,降低细胞凋亡率,改善神经功能缺陷评分,提高7天生存率。结论:治疗性低温联合硫化氢减轻心肺复苏后海马内质网应激,联合效果优于单独应用。总结1.心跳骤停后的全脑缺血再灌注损伤可以刺激内质网应激相关蛋白过度表达,造成海马CA1区细胞损伤,神经细胞凋亡,外源性硫化氢可以减轻心肺复苏后大鼠海马细胞凋亡,其机制与抑制内质网应激有关。2.治疗性低温可以有效降低心肺复苏后内质网应激相关蛋白的过度表达,减轻神经元凋亡,改善神经功能预后,提高7天生存率,与硫化氢联合应用其脑复苏效果最佳。