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瘢痕疙瘩(keloid)是病理性瘢痕(pathologic scar)的临床亚型,见于外伤或其他机械损伤后异常性修复,临床表现为红色增生性凸起,质地坚硬且伴有瘙痒疼痛,是一种难治性的皮肤肿瘤。目前瘢痕疙瘩形成机制尚不清楚,学界认为其发生是成纤维细胞过度增殖产生的病理结果。国内外研究证实哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路在成纤维细胞的生长分化凋亡过程中起到关键性作用。该信号通路的激活可以使细胞的正常生长周期得到启动,但是过度的激发也可以导致细胞的增殖异常。mTOR信号通路主要由第10号染色体张力缺失蛋白(PTEN)/磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)构成,PTEN对信号通路的激活具有着拮抗作用,PI3K、AKT是信号通路传递的必要途径,mTOR分子是信号通路作用的下游靶蛋白。因此研究如何抑制mTOR信号通路的过度活化成为预防治疗瘢痕疙瘩过度增殖的热点。中药外用药膏五倍子瘢痕膏诱导成纤维细胞凋亡,促使瘢痕的消退,治疗瘢痕疙瘩的疗效得到证实,但具体干预机制尚不明确,本文通过检测mTOR信号通路中关键分子PTEN、PI3K、AKT、mTOR在五倍子瘢痕膏干预下的瘢痕疙瘩组织、基质涂抹后瘢痕疙瘩组织及正常皮肤组织中的表达情况,分析三组关键分子表达的相关性,为临床使用五倍子瘢痕膏治疗瘢痕疙瘩提供理论和实验依据。研究目的研究瘢痕疙瘩及正常皮肤mTOR信号通路中关键分子 PTEN、PI3K、AKT、mTOR的表达情况,及五倍子瘢痕膏对mTOR信号通路是否存在影响,并明确五倍子瘢痕膏作用的靶点。研究内容与方法本次实验以瘢痕疙瘩成纤维细胞为研究对象,将人瘢痕疙瘩组织移植裸鼠背部进行造模,以涂抹五倍子瘢痕膏作为实验组,涂抹基质为对照组,再以正常皮肤组织做空白对照组,通过免疫组化技术研究mTOR信号通路关键分子PTEN、PI3K、Akt、mTOR在三组中表达差异性,明确化瘀软坚解毒法的作用机制和靶点。实验采用6周龄裸鼠(BALB/C-nunu品系),雌性,体重18-22g,购买自徐州医科大学实验动物中心,四批共37只,无菌环境下适应性饲养1周。在严格的无菌操作下,将手术切下的人前胸瘢痕疙瘩切成5mm×7mm×3mm大小组织块,将瘢痕疙瘩组织块种植到裸鼠背部皮下,约16天后,做成活体的瘢痕疙瘩动物模型。选取状态良好的BALB/C品系雌性裸鼠18只,将裸鼠随机分2组,对照组和实验组,每组9 只。实验组和对照组于创面上皮化时即开始用药。实验组涂抹五倍子瘢痕膏,对照组仅涂抹基质(制作瘢痕膏的基质)。每天观察种植的瘢痕疙瘩情况。将五倍子瘢痕膏及基质涂在瘢痕部位,3次/天,28天后处死裸鼠取材,同时取徐州市中医院皮肤外科手术中新鲜包皮组织作为空白对照,三组组织分别行HE染色,免疫组化SP法检测PTEN、PI3K、Akt、mTOR含量变化,拍照记录保存,使用IBMSPSS20.0软件包对数据统计分析。研究结果1PI3K主要在瘢痕疙瘩成纤维细胞的细胞质与少量细胞核中表达,呈棕黄色,五倍子瘢痕膏治疗组(33.33%)和正常皮肤(40.00%)中低表达,基质对照组瘢痕组织(77.78%)中高表达,差异有统计学意义(P<0.05)。2.PTEN在瘢痕疙瘩中主要表达在成纤维细胞细胞核与少量细胞质中,呈棕黄色,在基质对照组瘢痕疙瘩(22.22%)中低表达,五倍子瘢痕膏治疗组(88.89%)和正常皮肤(100.00%)中有高表达,差异有统计学意义(P<0.05)3.mTOR在瘢痕疙瘩中主要表达在成纤维细胞细胞质与少量细胞核中,呈棕黄色,五倍子瘢痕膏治疗组(11.11%)和正常皮肤(00.00%)中低表达,基质对照组瘢痕组织(77.78%)中高表达,差异有统计学意义(P<0.05)。3.Akt在瘢痕疙瘩中主要表达在成纤维细胞细胞核与少量细胞质中,呈棕黄色,在基质对照组瘢痕疙瘩(100.00%)中高表达,五倍子瘢痕膏治疗组(33.33%)和正常皮肤(60.00%)中有低表达,差异有统计学意义(P<0.05)4.Person相关性分析显示,瘢痕疙瘩中PTEN与PI3K、mTOR、Akt呈负相关(P<0.05),PI3K 与 mTOR、Akt 呈正相关(P<0.05),Akt 与 mTOR 呈正相关(P<0.05)。结论1.瘢痕疙瘩成纤维细胞中mTOR信号通路表达存在异常,PTEN、PI3K、AKT、mTOR是其中的关键分子,通过五倍子瘢痕膏干预后,瘢痕疙瘩成纤维细胞中PI3K、AKT、mTOR表达受到抑制,PTEN表达增强,表达水平与正常皮肤组织相近,这说明五倍子瘢痕膏治疗瘢痕疙瘩的疗效确切,其通过mTOR信号干预瘢痕成纤维细胞增殖的效应可以证实,该信号通路中药物作用的信号靶点为PTEN、PI3K、AKT、mTOR。为后续研究五倍子瘢痕膏治疗瘢痕疙瘩的研究提供理论基础。