论文部分内容阅读
杆状病毒是一类具有囊膜的双链环状DNA病毒,在其生活史中,产生两种不同类型的病毒粒子:出芽型病毒粒子(budded virus,BV)和包埋型病毒粒子(occlusion-derived virus,ODV)。ODV负责病毒对中肠初始的口服感染,而BV则介导虫体其他组织之间的系统感染。在ODV囊膜表面分布着至少10个与口服感染相关的蛋白,被称为口服感染因子(per os infectivity factors,PIFs)。P74作为首个被报导的口服感染因子,也被称为PIF0,它在ODV感染中肠的过程中经历两次顺序剪切:第一次剪切发生于ODV从多角体(occlusion body,OB)碱解释放的过程中;第二次剪切发生于ODV感染中肠上皮细胞的过程中。目前,对于P74第一次剪切的具体位点及其对口服感染的影响尚不明确。本论文对ODV囊膜蛋白P74的剪切现象进行了深入分析研究,同时还探究了ODV囊膜表面口服感染因子间的相互作用,为深入揭示杆状病毒口服感染的机制奠定了基础。第一章介绍了研究背景,包括杆状病毒的生活史及口服感染的详细过程。同时对口服感染因子,特别是P74的研究现状进行总结分析。第二章对苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus,AcMNPV)P74蛋白的剪切进行了研究。使用感染细胞样品和虫体来源的ODV样品进行Western blot检测,发现P74在细胞中不发生剪切,而在ODV样品中发生剪切。随后使用特异性抑制胰酶活性的大豆胰蛋白酶抑制剂(soybean trypsin inhibitor,SBTI)进行OB碱解的时相实验,发现SBTI加入时间越晚,P74剪切后的蛋白量越多,由此我们认为P74第一次剪切的可能是由胰蛋白酶或是类胰蛋白酶介导的。随后,根据剪切条带的大小及生物信息学分析,推测了四个保守的精氨酸位点可能为剪切位点,并通过Bac-to-Bac系统构建了缺失p74,回复p74及七种预测剪切位点单、多点组合突变的重组病毒。我们对重组病毒进行扫描电镜及透射电镜观察,发现p74缺失及点突变不影响OB的外部形态及内部ODV的包埋。我们将重组病毒的ODV纯化后进行Western blot检测,发现点突变R325Q/R334Q能够部分抑制P74剪切,四点突变R319Q/R323Q/R325Q/R334Q能够完全抑制P74的剪切,而其他的突变体不能,表明P74发生第一次剪切的位点是第319、323、325和334位的精氨酸。第三章对AcMNPV ODV囊膜表面10个口服感染因子之间的相互作用进行了探究。该实验通过酵母双杂交的方法双向验证各个PIF之间的相互作用,除去PIF5和VP91存在自激活现象无法研究外,共发现了8对双向互作的蛋白,分别是:P74-PIF4、PIF1-PIF2、PIF1-PIF3、PIF1-PIF4、PIF2-PIF3、PIF2-PIF4、PIF3-PIF4、PIF4-Ac110。该实验提示PIFs之间存在着广泛的相互作用,支持了PIF以复合物形式发挥功能这一发现,并为探究各个PIF蛋白在PIF复合物中可能的排布方式提供了重要数据。第四章为总结和展望,对本文的研究进行了总结归纳。