塔玛亚历山大藻核酸适配体的筛选及鉴定

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赤潮也称有害藻华(Harmful algal blooms,HABs),是指在特定的水体环境条件下,因浮游植物、原生动物或细菌等生物数量急剧增长而引起的一种异常生态现象。塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)是能够产生麻痹性贝毒(Paralytic shellfish toxins,PSTs)的甲藻中分布范围最广和认知度最高的物种之一,已经对海洋渔业资源和人类的生命健康构成了严重威胁。因此,建立一种快速、准确的塔玛亚历山大藻检测方法,对于监测该藻造成的HABs以及限制PSTs对海产品的污染极为重要。本研究基于全细胞指数富集的配基系统进化技术(Whole cell systematic evolution of ligands by exponential enrichment,WC-SELEX)开展了针对塔玛亚历山大藻适配体的筛选,旨在将适配体用作塔玛亚历山大藻的新型细胞分子识别原件,建立自然水样中塔玛亚历山大藻的快速检测方法。首先,本论文分别对塔玛亚历山大藻、利玛原甲藻(Prorocentrum lima)、东海原甲藻(P.donghaiense)以及海洋原甲藻(P.micans)进行分子鉴定。通过试剂盒法分别对4种微藻的基因组DNA进行提取,然后以4种藻细胞的核糖体大亚基(Ribosomal large subunit,LSU)作为靶序列进行PCR扩增。扩增得到的产物经切胶回收后,进行T-A克隆。利用菌液PCR法筛选出阳性克隆菌株,送到生物公司测序。在NCBI上对测序结果进行比对分析后,确定了目标藻种与反筛藻种的正确性。其次,本论文以人工合成的随机ssDNA适配体文库(包括上游PCR引物结合区18 nt、下游PCR引物结合区19 nt以及中间随机序列43 nt)为初始文库,以塔玛亚历山大藻为目标藻种,以利玛原甲藻、东海原甲藻和海洋原甲藻为反筛藻种,利用WC-SELEX技术筛选出特异性结合塔玛亚历山大藻的次级ssDNA文库。期间不断进行扩增条件的优化和筛选压力的调整,并在第5轮开始引入反筛。利用流式细胞术对结合能力的变化进行监测,经过连续18轮的重复筛选,最终得到能够识别塔玛亚历山大藻的候选适配体库。经克隆测序之后获得了30条候选适配体。最后,本论文将候选适配体通过一级结构序列分析和二级结构模拟后,按照同源性分为3个家族,即Family 1、Family 2和Family 3;按照二级结构相似性分为5个家族,包括Family A、Family B、Family C、Family D和Family E。最后选取来自Family 3家族的二级结构代表Ata19(Family A)、Ata6(Family B)、Ata25(Family C)和Ata29(Family D)作为适配体,依次进行亲和力和交叉反应测试。亲和力测试结果表明,4条适配体的平衡解离常数(KD)均在纳摩尔(n M)范围。其中,Ata6和Ata19亲和力较好,KD值分别为(360.23±123.01)n M和(162.78±20.35)n M。交叉反应测试结果显示:Ata6的特异性较差,而Ata19、Ata25和Ata29的特异性较强,与11种引起HABs的常见微藻没有发生交叉反应。研究通过荧光显微镜验证Ata19与塔玛亚历山大藻的结合能力,结果发现塔玛亚历山大藻在显微镜下整体均呈现明亮的绿色荧光,极易被识别。因此,综合亲和力与特异性研究结果,Ata19可作为塔玛亚历山大藻理想的细胞分子识别原件,应用于后续针对塔玛亚历山大藻检测方法的建立。
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