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研究背景及目的:肝细胞性肝癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是一种恶性肿瘤,严重威胁着人类的生命健康。大部分HCC患者就诊时病程达中晚期,无法进行手术治疗,化疗成为中晚期HCC的首选治疗方式。但临床上随着疗程的推进HCC患者极易产生化疗抵抗。肿瘤细胞对化疗药物的不敏感导致患者后期疗效不明显,甚至与患者的不良预后息息相关。因此探讨HCC对化疗不敏感的分子机制以及相应的增敏化疗措施显得尤为重要。索拉非尼（sorafenib）是FDA批准用于HCC的分子靶向药,由于其有效性和安全性被视为一线化疗药。但仍然有部分患者对索拉非尼的治疗没有明显的疗效,反而增加索拉非尼带来的副作用和治疗的经济负担。因此探讨HCC对索拉非尼治疗不敏感的分子机制以及可行的增敏措施,成为近年来研究的热点。长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）是长度大于200nt,不能编码蛋白质的RNA。大部分lncRNA与miRNA结合,减少或抑制miRNA与下游靶m RNA的3’-UTR的结合能力,促进靶基因的表达,最终调控细胞各项生理功能。微小RNA（micro RNA,miRNA）是长度约为22nt的小分子RNA,miRNA可以与靶m RNA的3’-UTR发生特异性的碱基互补配对从而抑制靶基因的表达。SPRY4-IT1是一种内含子lncRNA,长708nt。有研究报道,SPRY4-IT1在多种肿瘤中呈现明显的高表达并促进肿瘤的发生发展。miR-101-3p长21nt,在多种肿瘤组织和细胞系中呈现低表达水平,通过调控下游靶m RNA的表达水平而促进肿瘤细胞的增殖迁移等。EZH2是一种甲基转移酶,能使组蛋白H3上的赖氨酸27（K27）发生甲基化。多篇研究报道,EZH2通过增强肿瘤细胞的增殖能力而促进肿瘤的发生发展过程。到目前为止,SPRY4-IT1/miR-101-3p/EZH2通路在HCC细胞中是否存在、该通路在调节HCC细胞对索拉非尼敏感性方面有何作用尚未见报道。因此在HCC细胞中确立SPRY4-IT1/miR-101-3p/EZH2通路的存在,并探讨其在增强HCC细胞对索拉非尼敏感性中的意义,对于设计针对索拉非尼的临床治疗方案,提高其治疗效果具有重要意义。研究内容及方法:第一部分抑制SPRY4-IT1表达增强HCC细胞对索拉非尼敏感性1.全转录组物测序筛选经索拉非尼处理后HCC细胞中表达水平差异显著的lncRNA。2.Real-time PCR验证所筛选差异lncRNA在索拉非尼处理HCC细胞中的表达变化。3.CCK-8实验检测敲低SPRY4-IT1后能否增强HCC细胞对索拉非尼的敏感性。4.克隆形成实验检测敲低SPRY4-IT1后能否促进索拉非尼对HCC细胞的增殖抑制。5.Brd U流式细胞术检测敲低SPRY4-IT1后能否增强索拉非尼对HCC细胞的增殖抑制。第二部分SPRY4-IT1通过下调miR-101-3p表达而降低HCC细胞对索拉非尼的敏感性1.生物信息学预测可能与SPRY4-IT1存在结合的miRNA及其结合位点。2.Real-time PCR检测预测的miRNA在索拉非尼处理HCC细胞中的表达变化。3.CCK-8实验检测过表达miR-101-3p能否增加HCC细胞对索拉非尼的敏感性。4.克隆形成实验检测上调miR-101-3p后能否促进索拉非尼对HCC细胞的增殖抑制。5.Brd U流式细胞术检测上调miR-101-3p后能否增强索拉非尼对HCC细胞的增殖抑制。6.Real-time PCR检测上调或敲低SPRY4-IT1对miR-101-3p表达的影响。7.CCK-8实验检测上调miR-101-3p能否逆转过表达SPRY4-IT1引起的HCC细胞对索拉非尼敏感性降低。第三部分miR-101-3p通过下调EZH2表达增加HCC细胞对索拉非尼的敏感性1.Starbase数据库预测miR-101-3p与EZH2 m RNA的3’-UTR区是否结合及结合位点。2.Real-time PCR和Western blot实验检测EZH2在索拉非尼处理HCC细胞中的表达变化。3.CCK-8实验检测EZH2抑制剂能否增加HCC细胞对索拉非尼的敏感性。4.克隆形成实验检测抑制EZH2能否促进索拉非尼对HCC细胞的增殖抑制。5.Brd U流式细胞术检测抑制EZH2后能否增强索拉非尼对HCC细胞的增殖抑制。6.Real-time PCR和Western blot检测上调或敲降miR-101-3p对EZH2表达的影响。7.双荧光素酶报告基因检测miR-101-3p与EZH2 m RNA的3’-UTR区是否存在直接结合。第四部分SPRY4-IT1通过调节miR-101-3p/EZH2通路调控HCC细胞对索拉非尼的敏感性1.Real-time PCR和Western blot检测过表达SPRY4-IT1对EZH2表达的影响。2.Real-time PCR和Western blot检测沉默SPRY4-IT1对EZH2表达的影响。3.Real-time PCR和Western blot检测沉默miR-101-3p能否阻断抑制SPRY4-IT1后造成的EZH2表达下调。4.Real-time PCR和Western blot检测过表达miR-101-3p能否阻断上调SPRY4-IT1后造成的EZH2表达上调。研究结果:第一部分抑制SPRY4-IT1表达增强HCC细胞对索拉非尼的敏感性1.全转录组物测序筛选出经索拉非尼处理后HCC细胞中表达水平变化最大的十条lncRNA。2.SPRY4-IT1在索拉非尼处理HCC细胞中稳定上调。3.敲低SPRY4-IT1能够显著增强HCC细胞对索拉非尼的敏感性。4.敲低SPRY4-IT1后能促进索拉非尼对HCC细胞的增殖抑制。第二部分SPRY4-IT1通过下调miR-101-3p表达而降低HCC细胞对索拉非尼的敏感性1.生物信息学预测表明,存在多种与SPRY4-IT1结合的miRNA及其结合位点。2.所筛选miRNA中miR-101-3p在索拉非尼处理HCC细胞中表达稳定下调。3.过表达miR-101-3p能够显著增强HCC细胞对索拉非尼的敏感性。4.上调miR-101-3p后能促进索拉非尼对HCC细胞的增殖抑制。5.过表达或沉默SPRY4-IT1能够在HCC细胞中下调或上调miR-101-3p表达。6.上调miR-101-3p能够逆转过表达SPRY4-IT1引起的HCC细胞对索拉非尼敏感性降低。第三部分miR-101-3p通过下调EZH2表达增加HCC细胞对索拉非尼的敏感性1.生物信息学预测表明,miR-101-3p与EZH2 m RNA的3’-UTR区存在直接结合。2.EZH2的表达水平在索拉非尼处理HCC细胞中稳定上调。3.EZH2抑制剂显著增强HCC细胞对索拉非尼的敏感性。4.抑制EZH2能促进索拉非尼对HCC细胞的增殖抑制。5.在HCC细胞中过表达miR-101-3p能下调EZH2的表达。6.在HCC细胞中沉默miR-101-3p能够上调EZH2的表达。7.miR-101-3p与EZH2 m RNA的3’-UTR区存在直接结合。第四部分SPRY4-IT1通过调节miR-101-3p/EZH2通路调控HCC细胞对索拉非尼的敏感性1.在HCC细胞中过表达SPRY4-IT1能够显著上调EZH2的表达。2.在HCC细胞中沉默SPRY4-IT1能够显著下调EZH2的表达。3.在HCC细胞中沉默miR-101-3p能够阻断下调SPRY4-IT1后造成的EZH2表达下调。4.在HCC细胞中过表达miR-101-3p能够阻断上调SPRY4-IT1后造成的EZH2表达上调。结论:在HCC细胞中,lncRNA SPRY4-IT1能被索拉非尼稳定上调,敲低SPRY4-IT1的表达水平能增强HCC细胞对索拉非尼的敏感性。SPRY4-IT1通过下调miR-101-3p的表达水平,从而抑制miR-101-3p与EZH2 m RNA的3’-UTR区结合,导致EZH2的表达水平上调,最终使HCC细胞对索拉非尼的敏感性降低。通过使用SPRY4-IT1的si RNA或EZH2的抑制剂能够有效的增强HCC细胞对索拉非尼的敏感性。