目的:作为人体最大的器官——皮肤,居于人体最外层,是人体免疫系统的第一道防线。当第一道防线受损时,如临床常见的烫伤、烧伤、手术创伤、意外创伤,皮肤感染细菌的风险也随之增高。皮肤细菌性感染中最常见的细菌是金黄色葡萄球菌,这种细菌可能引起中度到重度感染,严重时可危及生命,是医院里最常见细菌感染,也是引起住院患者死亡的主要原因。极端的发病率和死亡率很大程度上与菌株携带的基因对多种抗生素产生耐药性有关,其耐药范围包括了目前使用最广泛的青霉素及其衍生物。从青霉素问世至今,其使用率不断增高,自然选择作用使得部分金黄色葡萄球菌逐渐对其表现出耐药性,甲氧西林(methicillin)曾有效控制了耐药菌的感染。后来,由于甲氧西林的作用,衍生出了耐甲氧型西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)和甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-sensitive Staphylococcus aureus,MSSA)两种细菌。MRSA除对甲氧西林耐药外,其广谱耐药的特性和拥有不同耐药机制的特性使其对包括氨基糖苷类、四环素类、大环内酯类等在内的多种抗生素均产生耐药性。自1961年在英国发现MRSA以来,MRSA检出率正逐年上涨,几乎遍及全球,成为临床上常见的毒性较强的细菌。且抗生素滥用带来细菌耐药的问题,若任由不断地发展,可能导致细菌对所有的抗生素耐药,人类有可能进入后抗生素时代,医生面对耐药的细菌将处于无药可用的境况。因此MRSA感染问题已成为当今世界范围内防治细菌感染的难题和焦点。从中草药中提取单体化合物用于临床疾病的治疗在我国不仅有着悠久的历史,而且在现代医疗体系中也发挥着越来越重要的作用。其不易耐受,价格低廉易取,疗效明显,副作用小等优势更便于患者长期服用。在21世纪的今天,加强对中草药的开发研究,不仅传承了中华民族千百年来的积累的知识经验,也为防控、对抗世界性疾病提供切实有效的治疗经验和方法。本研究运用LC-MS导向分离技术,提取分离木豆叶中芪类单体化合物,得到系列茋类化合物1-5;选取临床分离的标准株MRSA JCSC4744,首次展开系列茋类化合物体内、外抗菌活性和抗菌机制初步研究,致力于寻找具有抗MRSA活性的先导化合物。方法:1.茋类化合物的富集与单体的分离。木豆叶阴干称重20 kg,粉碎,用95%工业酒精室温浸泡3次,每次7天,合并提取液,减压浓缩至无乙醇味,得到总浸膏(3.53 kg)。浸膏用水悬浮,乙酸乙酯萃取,减压浓缩萃取液,得到乙酸乙酯部位(1.34 kg)。根据文献报道,木豆叶中茋类化合物的分子量基本在250-350范围内,随后对获得的乙酸乙酯部位进行LC-MS分析,同时结合芪类化合物结构的强紫外吸收的特点,筛选出茋类化合物富集的部位,并根据茋类化合物富集部位在HPLC中的保留时间,选用合适的柱层析手段,对其进一步富集和分离纯化,获得单体化合物。对分离获得的化合物,通过1H、13C、DEPT等1DNMR数据,结合质谱等理化常数,确定化合物的结构。2.测定茋类单体化合物1-5的最小抑菌浓度(MIC,minimal inhibitory concentration)和最小杀菌浓度(MBC,minimum bactericidal concentration)。采用微量稀释法,使96孔板中第1孔至第10孔药物浓度依次为100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL、3.12μg/mL、1.56 μg/mL、0.78 μg/mL、0.39μg/mL、0μg/mL。将100μL含有106CFU/mL的测试菌和刃天青显色剂(0.06 mg/mL)的MH培养基加入各孔中,孵育12 h。设置阳性对照万古霉素(Van,vancomycin)组,每种抗菌药物做3个复孔。MIC定义为保持蓝色的最低抗生素浓度。美国临床实验室标准化协会(CLSI,Clinical and Laboratory Standards Institute)药敏试验中规定,MBC 为能够杀死大于99.9%初始细菌含量的最低药物浓度。3.茋类化合物1-5对标准菌株MRSA JCSC4744动态杀菌曲线。以木豆素A(LLA)为例,取稀释至1 × 106 CFU/mL的MRSA菌液1.8 mL于24孔板,分别加入 7.8μg/mL 万古霉素、62.5μg/mL 万古霉素、15.6μg/mL 木豆素 A、125μg/mL 木豆素 A 各 0.2 mL,则分别得到 0.78μg/mL(1 × MIC)万古霉素、6.25μg/mL(8 × MIC)万古霉素、1.56μg/mL(1 × MIC)木豆素 A、12.5μg/mL(8 × MIC)木豆素 A 处理液。将24孔板置于37℃恒温箱孵育,分别在孵育的第0h、0.5h、2h、4h、8h、24 h测定各组细菌数量;培养时间为横坐标,细菌数量的对数为纵坐标,绘制木豆素A杀菌曲线,分析其动态杀菌效应。同样的方法测定化合物2-5杀菌曲线。4.木豆素A体内抗MRSA实验。将6-8周龄SPF级雌性Balb/c小鼠随机分为空白组、MRSA模型组、MRSA+Van组、MRSA+LLA组,每组12只。小鼠剃毛后,在背部开达筋膜的创口(直径1 cm)。除空白对照组外,每个小鼠伤口部位接种菌造模,并在对应组别涂覆PBS、0.2 mg/mL万古霉素药物和0.2 mg/mL木豆素A各50μL。每两天计录每只小鼠的体重、伤口大小,直至小鼠伤口愈合;感染MRSA第3天,每组随机抽取小鼠,测伤口细菌数量、血清中肿瘤坏死因子(TNF-α,tumour necrosis factor-alpha)、白介素6(IL-6,interleukin-6)含量,对其伤口皮肤组织进行革兰氏染色(Gram)、吉姆萨染色(Giemsa)、免疫组化(IHC,immunohistochemistry)染色实验,分析木豆素A体内抗菌活性。5.茋类化合物1-5抗MRSA机制初步探讨。使用“细胞膜极性分析法”分析化合物是否通过破坏MRSA菌株的细胞壁来达到抗菌作用;取对数生长期的MRSA JCSC4744标准株,用缓冲溶液(pH=7.0的5 mM HEPES)洗涤,重悬获得OD600=0.1 的细菌悬液,后加入 0.4μM 染色剂 3,3-dipropylthiacarbocyanine(DiSC3-5),37℃黑暗处理20 min,再分别加入系列浓度的1-5(0.5 × MIC、1 × MIC、2 × MIC、4 × MIC、8 × MIC)或等体积的DMSO,并在激发波长为660 nm和发射波长为675 nm的情况下监测荧光的变化;使用“SYTOX Green吸收分析法”分析化合物是否通过破坏MRSA菌株的细胞膜来达到抗菌作用。取对数生长期的MRSAJCSC4744标准株,然后将细胞悬浮在0.85%NaC1缓冲液中,重悬获得OD600=0.2的细胞悬液。将细菌悬浮液分别与系列浓度的化合物 1-5(0.5 × MIC、1 × MIC、2 × MIC、4 × MIC、8 × MIC)、蜂毒肽(MLT,Melittin)、DMSO孵育4h,然后与3 mM SYTOX green孵育5 min。在激发波长504 nm和发射波长523 nm下测量荧光;扫描电镜(SEM scanning electron microscope)实验,将指数生长状态的细菌与8 × MIC的1-5化合物或等体积的DMSO溶液37℃,处理4 h。将细胞洗涤3次,悬浮在PBS中,并在含有2%戊二醛和2.5%多聚甲醛的PBS中放置过夜。然后将样品在1%四氧化锇中固定2.5 h。用PBS洗涤3次后,将样品通过分级乙醇系列脱水,冷冻干燥,固定,涂金,拍照观察。结果:1.在LC-MS导向分离技术支持下,从木豆叶乙酸乙酯部位快速获得5个茋类化合物,经核磁数据与文献对比,鉴定其结构为:木豆素A(longistyline A)(1)、木豆素(cajanine)(2)、木豆素C(longistyline C)(3)、2-羟基-4-甲氧基-3-异戊烯基-6-苯乙基苯甲酸(2-hydroxy-4-methoxy-3-isopentenyl-6-phenethylbenzoic acid)(4)、3-甲氧基-5-羟基-2-(3-甲基-2-丁烯基联苄)(3-methoxy-5-hydroxy-2-(3-methyl-2-butenylbibenzyl))(5)。2.MIC与MBC实验结果表明对耐药菌株MRSA(JCSC4744、JCSC4469)菌株,1 的 MIC、MBC 均为 1.56μg/mL;2 的 MIC、MBC 均为 6.25μg/mL;3 的 MIC、MBC均为 12.5 μg/mL;4 的 MIC 为 3.12-6.25μg/mL、MBC 为 3.12-6.25μg/mL;5 的 MIC为 50μg/mL;Van 的 MIC 为 0.78μg/mL、MBC 为 1.56μg/mL。对金黄色葡萄球菌(S aureus,Staphylococcus aureus),茋类化合物1-5也显示良好的杀菌活性;对于蜡样芽胞杆菌(B.cereus,Bacillus cereus),茋类化合物1-4相较于万古霉素的MIC、MBC值较小;茋类化合物1-5对大肠杆菌(E coil,Escherichia coli)未显示明显得抗菌活性。3.Time-killing杀菌实验,选择MRSAJCSC4744进行实验研究。结果显示,浓度为8 × MIC的化合物1-5处理组,前0.5 h内细菌数量迅速降低,显示化合物1-5快速的杀菌功效;浓度为1 × MIC的1-5处理组,8 h后,MRSA存活率迅速降低3 × log(降低了 99.9%),而Van需要24 h才能达到相同的杀菌效果。4.感染MRSA第3天,LLA和Van处理的感染小鼠显示出伤口愈合趋势,与此相反的是MRSA模型组感染小鼠的切除区域出现明显化脓现象,且所有小鼠在5天内全部死亡。到第7天,除模型组外的其他组小鼠伤口均可见结痂现象,空白对照组显示出最佳的伤口愈合功效,其次是LLA组;此外,LLA和Van组与对照组几乎有相同伤口治愈时间,且均缓解了感染MRSA引起的体重减轻现象。皮肤组织细菌计数实验中可以看出,LLA、Van处理后细菌数量极显降低(P<0.01),这也与革兰氏染色实验结果一致,革兰氏染色结果显示,Van和LLA处理的感染小鼠显示微弱的阳性反应;与Van组相比,LLA组降低MRSA细菌数量更显著(P<0.05)。吉姆萨染色、免疫组化染色以及炎症因子TNF-α、IL-6检测实验均表明用LLA处理后显著降低小鼠免疫反应:模型组血清 IL-6 为 606.57±68.99 pg/mL,TNF-α为 280.58±42.27 pg/mL,经LLA治疗后,两种炎症细胞因子降低至180.74±10.78 pg/mL,87.25±10.19 pg/mL,显著降低小鼠免疫反应(P<0.05,P<0.01)。5.细胞质膜去极化分析研究中,与DMSO空白组比较,在浓度为0.5 × MIC、1 ×MIC、2 × MIC、4 × MIC、8 × MIC的茋类化合物1-5处理后,荧光信号的显着增加,且荧光信号与时间、剂量呈正相关;SYTOX green实验结果显示,SYTOX green核酸染料与 MRSA 和浓度为 0.5 × MIC、1 × MIC、2 × MIC、4 × MIC、8 × MIC 茋类化合物1-5处理4h后,荧光强度增加,且存在明显的量效关系;SEM实验中,8 × MIC化合物1-5处理MRSA细胞4 h后,观察到MRSA细胞有不同程度的裂解,膜上有囊泡等现象。结论:1.木豆叶中含有多种茋类化合物且其含量丰富。2.茋类化合物1-5对MRSA显示不同程度的抗菌活性,其中LLA对MRSA JCSC4744的MIC为1.56μg/mL,表现出较强抗菌活性。3.Time-killing实验表明茋类化合物1-5在1 × MIC、8 × MIC浓度均表现高效的杀菌活性。4.体内抗菌实验表明LLA细胞毒性较小,且能缓解感染MRSA带来的体重降低的影响,加快伤口愈合、降低死亡率、降低伤口细菌数量、降低血清中TNF-α和IL-6炎症因子,降低免疫反应。5.茋类化合物1-5抗菌机制与细菌细胞膜电位的耗散、破坏膜的渗透性、诱导细菌裂解有关。