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由造血微环境损伤引起的慢性骨髓抑制是化疗的严重副作用之一。5-氟尿嘧啶（5-FU）已被证实对骨髓基质细胞有氧化损伤作用,但潜在的机制及其对造血细胞的间接损伤作用尚不清楚,充分了解其机制将有助于提供治疗化疗损伤的新策略和新靶点。骨髓血管周龛是造血干细胞定居的主要微环境,本研究从小鼠股骨和胫骨中分离培养血管周龛的重要组成成分——血管周间充质祖细胞,探讨5-FU对血管周间充质祖细胞的毒性以及与造血细胞相互作用的影响。传统中药当归具有抗氧化促造血的作用,当归多糖（Angelica sinensis polysaccharides,ASP）是当归的有效活性成分。本研究探讨ASP通过抗氧化作用拮抗5-FU,保护血管周间充质祖细胞,从而促进造血的机制。研究结果表明,ASP缓解5-FU引起的血管周间充质祖细胞氧化损伤;改善成骨/成脂分化失衡,从而促进造血因子SCF、CXCL12合成分泌,并增强血管周间充质祖细胞与造血细胞间粘附分子和信号分子的相互作用。在此基础上,ASP间接改善了与5-FU作用的饲养层共培养的造血细胞的氧化损伤,并通过下调过度激活的Wnt/β-catenin信号,延缓了氧化应激诱导的造血细胞早衰。研究为治疗减轻5-FU骨髓抑制毒性提供了实验依据和临床指导意义。方法1.胶原酶分离培养C57BL/6小鼠股骨、胫骨血管周间充质祖细胞,探讨当归多糖拮抗5-FU,对骨髓血管周间充质祖细胞生长以及龛功能的影响。实验设置对照组:常规培养;ASP组:常规培养基础上加入100μg/mL的ASP作用48 h;5-FU组:常规培养基础上加入25μg/mL的5-FU作用48 h;5-FU+ASP组:常规培养基础上加入浓度为100μg/mL的ASP预处理细胞,6 h后加入25μg/mL 5-FU作用48 h。琼脂糖凝胶电泳鉴定分离培养细胞的血管周间充质祖细胞特异性标记物Lep R、CXCL12、Nestin、OPN、Osterix、Runx2基因表达;台盼蓝计数活细胞;CCK-8检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞凋亡;SA-β-gal半乳糖苷酶染色检测衰老细胞;DCFH-DA荧光染色检测血管周间充质祖细胞内ROS水平;酶学法检测细胞MDA及SOD水平;茜素红染色检测细胞成骨分化潜能;油红O染色检测细胞成脂分化潜能;q RT-PCR检测成骨相关因子Runx2、Osterix、OPN和造血因子SCF、CXCL12,信号分子TPO、Ang-1、Jagged1以及黏附分子LFA-1、VCAM-1的基因表达。2.以血管周间充质祖细胞为饲养层建立与造血细胞的共培养体系,研究骨髓血管周龛损伤对造血细胞的影响以及当归多糖预处理的保护作用及其机制。将血管周间充质祖细胞饲养层分为四组:对照组、ASP组、5-FU组以及ASP+5-FU组,调整细胞浓度为2.5×10~8个·L-1,接种于35 mm~2培养皿中,待融合率达90%,药物作用48 h备用。无菌条件下冲取小鼠双侧股骨胫骨骨髓,Ficoll密度梯度离心法制备骨髓单细胞悬液,贴壁培养6 h后,收集悬浮造血细胞。调整造血细胞浓度为2.5×10~9个·L-1,种植于血管周间充质祖细胞饲养层上,共培养24 h。台盼蓝计数造血细胞活细胞数量;流式细胞术检测细胞凋亡;SA-β-gal半乳糖苷酶染色检测衰老细胞;酶学法检测造血细胞MDA及SOD水平;qRT-PCR检测造血细胞相关信号分子MPL、Tie-2、Notch以及黏附分子VLA-4、ICAM-1基因的表达。Western blot检测造血细胞衰老相关蛋白P53、P21及Wnt/β-catenin通路中关键信号分子β-catenin、Cyclin-D1、GSK-3β、P-GSK-3β的蛋白表达。结果1.琼脂糖凝胶电泳结果显示,从小鼠股骨胫骨分离提取的细胞高表达Lep R、CXCL12、Nestin、OPN、Osterix、Runx2基因,证实该细胞群主要为骨髓血管周间充质祖细胞。2.ASP减轻5-FU对血管周间充质祖细胞的生长抑制作用:台盼蓝活细胞计数显示5-FU处理后,血管周间充质祖细胞数量相比对照组减少,ASP预处理可显著提升细胞数量;CCK-8结果表明5-FU抑制血管周间充质祖细胞增殖,ASP预处理显著改善细胞增殖抑制。流式细胞术检测结果表明ASP预处理减轻5-FU所致的细胞凋亡;SA-β-gal半乳糖苷酶染色结果显示ASP预处理显著改善5-FU诱导的细胞衰老。3.ASP恢复5-FU损伤的血管周间充质祖细胞功能:DCFH-DA荧光染色和酶学实验结果表明,5-FU导致血管周间充质祖细胞抗氧化能力下降,细胞发生氧化应激;而ASP可降低血管周间充质祖细胞MDA水平,提高SOD含量,减少胞内ROS含量,逆转5-FU对细胞造成的氧化损伤。成骨诱导分化和成脂诱导分化结果提示,ASP逆转5-FU对血管周间充质祖细胞成骨分化潜能的抑制,成骨诱导分化后成骨结节明显增多,促进Runx2、Osterix和OPN成骨分化基因转录;同时ASP降低5-FU的诱导成脂分化作用,油红O染色结果显示存在脂滴的血管周间充质祖细胞数量明显减少,已分化细胞胞浆内脂滴体积缩小且数量显著减少。qRT-PCR结果显示,5-FU损伤导致骨髓血管周间充质祖细胞造血因子SCF、CXCL12,信号分子TPO、Ang-1以及黏附分子LFA-1、VCAM-1的基因表达下降,造血细胞信号分子MPL、Tie-2以及黏附分子VLA-4、ICAM-1的基因表达下降;而ASP可回调这些基因表达。4.ASP延缓因5-FU损伤血管周间充质祖细胞引起的造血细胞氧化应激性早衰:台盼蓝活细胞计数结果显示,5-FU组共培养造血细胞数量相比对照组明显降低,而ASP+5FU组共培养造血细胞数量相比5-FU组有显著性回升。流式细胞术显示,各组共培养造血细胞凋亡率无明显差异。SA-β-gal半乳糖苷酶染色结果显示,ASP+5-FU组共培养造血细胞衰老染色阳性率相比5-FU组显著降低。ASP减轻共培养造血细胞的氧化应激:5-FU组共培养造血细胞相比对照组MDA水平升高,SOD含量降低;ASP+5-FU组共培养造血细胞相比5-FU组MDA水平降低,SOD水平回升。5.ASP通过Wnt/β-catenin信号拮抗氧化应激诱导的造血细胞早衰:Western blot结果表明,5-FU作用的血管周间充质祖细胞饲养层上调了共培养造血细胞P53和P21蛋白的表达;而ASP预处理的饲养层下调了造血细胞胞内的衰老信号。5-FU组共培养的造血细胞中β-catenin、Phospho-GSK-3β和cyclin-D1表达上调,GSK-3β蛋白表达下调。相反,与5-FU组相比,ASP+5-FU组共培养的造血细胞β-catenin、Phospho-GSK-3β和cyclin-D1表达下调,GSK-3β蛋白表达上调。结论1.ASP拮抗5-FU对小鼠骨髓血管周间充质祖细胞的氧化损伤,减轻5-FU对骨髓血管周龛造血功能的毒副作用。2.ASP通过保护骨髓血管周间充质祖细胞延缓氧化应激诱导的造血细胞早衰,其机制可能与下调造血细胞内被过度激活的Wnt/β-catenin信号通路有关。