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犬新孢子虫(Neospora caninum,N.caninum),简称新孢子虫,隶属于顶复亚门,孢子虫纲,是一种严格的胞内寄生性原虫,引起新孢子虫病(Neosporiasis),临床症状以孕畜流产、死胎及新生胎儿运动神经系统障碍为主,给养殖业造成了巨大的经济损失。目前尚缺乏有效的药物或者疫苗进行防控,原因之一主要是对新孢子虫的致病机制及宿主的免疫应答了解不清楚。寄生虫病的发生是病原体和宿主共同作用的结果,受到病原微生物刺激后,宿主细胞通过病原模式识别受体(PRRs)来识别病原相关分子模式(PAMPs),从而启动抗寄生虫的天然免疫应答,以防止病原寄生虫的进一步感染,维持机体内环境的稳定,但具体的激活机制尚不清楚。细胞外囊泡(EVs)作为细胞向外界分泌的具有生物活性的小分子,由于其携带了丰富的蛋白质、脂质和核酸等物质,被认为是细胞间通讯的重要介质,能在细胞与细胞间或者细胞与周围环境间传递信号。大量研究表明,许多原生性寄生虫都能分泌EVs,并通过EVs进行信息传递,包括在虫体之间传递毒力因子、药物抗性基因等等,或者参与宿主的免疫应答过程,对寄生虫的发育、疾病的发展、甚至宿主应答均产生重要的影响。但是,新孢子虫是否会产生EVs,以及在宿主的天然免疫应答过程中发挥怎样的作用目前还未见报道。因此进行本研究,对新孢子虫EVs的研究将有助于我们进一步了解新孢子虫病的致病机制,为预防和治疗新孢子虫病提供新的诊断方法和治疗思路。新孢子虫胞外囊泡的分离鉴定和蛋白组学:通过差速超速离心方法收集新孢子虫胞外囊泡(NEVs),透射电镜和扫描电镜观察结果显示,收集的NEVs呈典型的“球状”或“杯托”状,具有明显双层膜结构,新孢子虫虫体周围可见大小均匀的囊泡样物质;纳米颗粒追踪显示NEVs大小均匀且平均粒径大小为124±20.89nm,浓度为5.1±1.32×109个/m L;鸟枪法(Shotgun)对NEVs进行蛋白质组学分析,共鉴定出705种蛋白质,包括Actin、14-3-3、HSP70/90、Enolase和Rab等外泌体标志性蛋白,KEGG分析蛋白参与的信号通路,705种蛋白共参与了97条信号通路,包括PI3K-Akt、MAPK、NOD样和Toll样信号通路等,表明NEVs参与了宿主细胞天然免疫应答的调控。新孢子虫胞外囊泡介导的TLRs宿主天然免疫应答机制:首先,本研究通过激光共聚焦和流式细胞术检测了NEVs与小鼠骨髓巨噬细胞(BMDMs)的相互关系,PKH67标记NEVs后再刺激BMDMs,结果显示2 h后,在宿主细胞中能检测到荧光信号,且随着时间的延长,荧光信号也不断增强,表明NEVs进入BMDMs呈时间依赖性,并且松弛素处理能显著抑制NEVs的摄入,表明NEVs进入小鼠BMDMs依赖于细胞的主动吞噬功能;之后,NEVs刺激小鼠BMDMs后,检测TLRs的激活情况,荧光定量结果显示,NEVs能显著激活TLR2、TLR3和TLR4;ELISA结果表明,NEVs刺激野生型(WT)小鼠BMDMs后炎性细胞因子IL-12p40、IFN-γ、TNF-α、IL-1β显著升高,TLR2缺陷型(TLR2-/-)小鼠BMDMs炎性细胞因子IL-12p40、TNF-α和IFN-γ明显低于WT组;Western blot结果显示WT组P38、ERK和JNK磷酸化水平明显高于TLR2-/-组,且P38、ERK和JNK抑制剂处理细胞后炎性因子IL-12p40、IL-6和IL-10的分泌量增高,表明NEVs能激活TLR2依赖的MAPK信号通路从而调控小鼠BMDMs的免疫应答过程。新孢子虫胞外囊泡蛋白转运试验和免疫调控分子Nc14-3-3的表达和功能研究:通过分析筛选出NEVs中的三种蛋白Nc14-3-3、Nc HSP70、Nc Enolase进行表达和特性研究,Western blot结果显示这三种蛋白都存在于NEVs中;用制备的抗体进一步检测NEVs进入宿主细胞的情况,免疫荧光结果显示,作用3 h后在小鼠BMDMs中能检测到蛋白的进入,且随着时间延长,蛋白量也在不断增加,表明NEVs能将携带的蛋白转运到宿主细胞内。随后进一步对Nc14-3-3进行了功能研究,成功表达纯化获得新孢子虫14-3-3蛋白(Nc14-3-3),免疫荧光和免疫电镜结果显示14-3-3蛋白主要位于虫体胞浆,少量位于细胞膜;Western blot和ELISA结果显示,Nc14-3-3能激活MAPK和AKT信号通路,促进炎性因子IL-12p40、IL-6和TNF-α的分泌,MAPK和AKT通路抑制剂处理后,炎性因子IL-12p40、IL-6和TNF-α的表达量明显降低,TLR2-/-组观察到了相同的结果,表明Nc14-3-3能激活MAPK和AKT信号通路调控宿主的炎性应答,此外Nc14-3-3还能激活NF-κB/p65信号通路,促进p65的入核;动物试验结果显示NEVs和Nc14-3-3免疫后再感染新孢子虫,能显著降低小鼠的死亡率、减少组织虫荷量、缓解组织病理变化,表明NEVs和Nc14-3-3可以作为抗新孢子虫的候选疫苗靶标。综上所述,本研究表明新孢子虫能分泌外泌体样胞外囊泡,NEVs能激活小鼠骨髓源巨嗜细胞天然模式识别受体TLR2/3/4,并通过TLR2依赖的MAPK信号通路调控下游炎性细胞因子IL-12p40和IFN-γ的表达和分泌;免疫调控分子Nc14-3-3能通过激活宿主MAPK、AKT和NF-κB/p65信号通路来调控小鼠腹腔巨噬细胞炎性细胞因子IL-12p40、IL-6和TNF-α的表达和分泌;并且NEVs和r Nc14-3-3免疫小鼠后能降低小鼠死亡率、延长小鼠存活时间、减轻组织病理变化。以上研究揭示了新孢子虫与宿主互作的一种新机制,且NEVs和r Nc14-3-3可以作为抗新孢子虫病的候选疫苗。