研究目的:铜绿假单胞菌对多种抗生素耐药,在治疗其感染的过程中,我们面临着严峻的挑战。嗜水气单胞菌耐药不仅对人类健康构成威胁,还给水产养殖业造成巨大的经济损失。因此迫切需要开发替代疗法和防治策略,即:在对耐药菌株不施加生存压力的前提下,通过信号通讯调控防治耐药菌株。细菌群体感应（quorum sensing,QS）系统的发现为预防和控制微生物感染提供了一种很好的研发思路。寻找新型群体感应抑制剂（QSI）,阻断细菌QS信号通讯,进而抑制生物被膜的产生可能是恢复耐药菌药敏性、治疗耐药菌感染的一条有效途径。植物内生菌资源丰富,其次生代谢产物结构多样,生物活性广泛,是天然药物的重要来源。槟榔在我国有一千多年的药食历史,位居“四大南药”之首。有研究表明槟榔具有很好的QSI活性,但其内生菌代谢物是否具有QSI活性?本课题以槟榔内生菌为研究对象,以本实验室已有的报告菌株为模型进行活性追踪,以期从内生菌的次生代谢产物中获得活性较好的新型QSI,为预防和治疗细菌感染提供理论依据。研究方法:从槟榔根、茎、叶中分离内生细菌、内生放线菌和内生真菌,通过液体培养基小量发酵获得乙酸乙酯提取物,通过报告菌株紫色杆菌CV026和根癌农杆菌KYC55进行QSI活性筛选。对筛选出的活性菌株进行富集发酵,结合活性追踪分离得到活性次级代谢产物。内生放线菌RC1因其优良且稳定的QSI活性而被优先用于放大培养。通过活性跟踪,从菌株RC1中分得一高含量具有QSI活性的化合物。在低于MIC下,评估了该化合物对铜绿假单胞菌PAO1的毒力因子（绿脓菌素、弹性蛋白酶、鼠李糖脂、铁载体、蛋白酶和运动能力等）的抑制活性;借助结晶紫染色法、激光共聚焦显微镜和扫描电子显微镜分析了该活性化合物对铜绿假单胞菌PAO1生物被膜形成的抑制作用;通过LC-MS/MS测定其信号分子水平、荧光实时定量PCR和分子对接探究了活性化合物降低铜绿假单胞菌毒力,减轻其致病性的作用机制。同样,在低于MIC下,评估了该化合物对嗜水气单胞菌SHAe 115的毒力因子（溶血素、蛋白酶和swimming等）的抑制活性;借助结晶紫染色法、激光共聚焦显微镜和扫描电子显微镜分析了该活性化合物对嗜水气单胞菌SHAe 115生物被膜形成抑制作用以及对已形成被膜的破坏作用;通过黄粉虫幼虫存活实验验证了活性化合物对嗜水气单胞菌毒力和致病性的影响。除此之外,在低于MIC下初步评估了该化合物对洋葱伯克霍尔德菌BCX 85的运动能力以及被膜形成的影响。研究结果:从槟榔根、茎、叶中共分离到内生细菌53株、内生放线菌6株、内生真菌54株。内生放线菌RC1经形态学和分子生物学法鉴定为:Streptomyces cyaneochromogenes。通过活性跟踪,从该菌株的代谢产物中分离出的高含量的活性化合物为放线菌素D（889.2 mg）。放线菌素D浓度为50、100和200μg/m L时可显著抑制铜绿假单胞菌PAO1中多种毒力因子的产生,包括绿脓菌素,蛋白酶,鼠李糖脂和铁载体。共聚焦激光扫描显微镜和扫描电子显微镜图像显示,放线菌素D处理导致生物被膜结构更松散更平坦,与结晶紫法定量结果一致。荧光实时定量PCR分析显示QS相关基因las I,rhl I,rhl R,pqs R,psl A和pil A的表达显著下调。QS信号分子N-（3-氧代十二烷酰基）-L-高丝氨酸内酯（3-O-C12-HSL）和N-丁酰基-L-高丝氨酸内酯（C4-HSL）的合成分别减少了45%和59%。放线菌素D浓度为12、25和50μg/m L时,可显著抑制嗜水气单胞菌SHAe 115蛋白酶和溶血素的生成,抑制生物被膜的形成,破坏已形成的被膜,并减弱其swimming及swarming运动能力。激光共聚焦扫描显微镜和扫描电子显微镜结果显示出其对生物被膜有明显的抑制和破坏作用。黄粉虫存活试验结果表明,放线菌素D可以有效减少嗜水气单胞菌的毒力,降低死亡率。放线菌素D浓度为3.125、6.25和12.5μg/m L时,对洋葱伯克霍尔德菌BCX85的swimming能力及被膜形成无明显抑制效果。有趣的是,放线菌素D使其swarming扩散圈增大,触须数目和长度显著增加。研究结论:本课题发现槟榔部分内生菌的次级代谢产物具有QSI活性。随后对放线菌素D的进一步研究发现,其可以通过干扰QS系统显著减少铜绿假单胞菌PAO1和嗜水气单胞菌SHAe 115的毒力,并影响与耐药密切相关的生物被膜的形成。