从古自今,生物发光现象一直吸引着人们的注意力,诱使着科学家们致力于解开生物发光的神秘面纱。生物有机体产生发光的原因包括种间交流、吸引猎物、狩猎和自卫等。虽然生物发光现象在几千年以前就已被记录,但是仅在上个世纪随着分子生物学的进步才逐渐揭开生物发光的潜在机制。生物发光的实质是一类酶催化氧化反应,是指生物体自带一种化合物被体内的酶催化发生化学反应将化学能几乎全部转变成光能的过程,化合物即为萤光素,酶为萤光素酶。NanoLuc生物发光体系是Promega公司完善的一种新颖的发光系统,于2012年正式问世,包括一种人工合成的萤光素—furimazine和优化的萤光素酶—NanoLuc。NanoLuc萤光素酶来源于一种深海虾Oplophorus gracilirostris,后经Promega公司利用基因工程改造得到,然后对大量化合物进行筛选和优化,获得了 furimazine,最终形成了发光特性卓越的NanoLuc-furimazine生物发光系统。该生物发光体系与其余的发光体系相比,具有如下优点:催化furimazine发光只需要酶和氧气的参与;NanoLuc酶具有最小的体积,只有19 kDa;酶和底物的稳定性增强;最为突出的是该体系生物发光强度是其他发光体系的150倍以上,且可产生辉光性的蓝色光信号。然而该发光体系也存在着以下缺点:第一,用于体内成像的最佳生物发射波长需大于600 nm,而该体系发射波长只有460 nm,易被组织吸收和散射,不利于体内成像;第二,底物单一,没有可替代的合适底物。虽然近几年科学家们已经对furimazine的特定位置进行了很多的改造优化,但是具有较好活性的化合物并没有被发现,并且在对改造的化合物发光性能方面没有系统的评价准则。本论文选择NanoLuc生物发光体系,以萤光素furimazine为基础,设计、合成新的NanoLuc类型化合物,并对该生物发光体系进行评价,以得到发光性能优越和可替换的生物发光底物。本研究内容可规划为两个部分:第一部分:基于底物furimazine,对其C-6取代位置进行修饰改造,从而设计、合成了 A系列的新型NanoLuc类型的发光底物。A系列底物的特点是在分子骨架咪唑并[1,2-a]吡嗪的C-6位置将苯环替换为不同的取代基团。我们对A系列化合物进行了酶水平、细胞水平、动物模型水平和对NanoLuc选择性方面的生物学评价。结果显示A系列大部分化合物具有优秀的发光特性:酶水平上所有的新型底物发射光谱的峰值均有所红移且大多数底物与萤光素酶的反应半衰期有所提升,尤其是底物A2的半衰期长达2 h以上,A6和A11的发光强度可比肩与furimazine;细胞水平上,所有化合物的发光强度均不如furimazine,其中A6和A11的亮度要强于其他的化合物;动物水平上,底物A11的发光强度强于furimazine且发光持续时间可达1 h以上。化合物A11有望成为用于科学研究新的NanoLuc类型发光底物。第二部分:以底物furimazine为基础,对其C-8位置进行修饰改造,设计、合成了 B系列生物发光底物。随后在酶水平、细胞水平和动物水平于发光强度、持续时间、发射波长方面进行了系统的活性评价,发现在酶水平,B1和B2的生物发光强度强于furimazine且生物发射波长展现出一定的红移,但是发光持续时间有所下降;相对于furimazine,B2的细胞水平生物发光强度得到了很大程度的提升;化合物B1和B2展示出卓越的体内发光性能,发光强度和持续时间远大于furimazine,尤其是B2发光强度是furimazine的50倍以上。B2具有的优秀发光特性,可望取代furimazine成为用于体内成像的新型NanoLuc类型的发光底物。我们从构效关系的角度分析A、B两个系列化合物的不同结构对酶发光性能产生的影响,分析如下:在C-6取代位置引入大分子共轭基团虽然发射波长表现出很大的红移但是发光强度下降的过于显著,这是由于萤光素酶与化合物反应的“口袋”较小,若分子结构太大化合物不利于进入结合“口袋”因此不能产生高强度的发光;在C-6位苯基上引入氟原子可以明显增加其发光时间如A2的发光半衰期长达2 h以上;C-6取代位置引入给电子取代基可明显降低发光强度,应尽量避免;C-8取代位置引入氧杂原子和硫杂原子可与母核产生p-π共轭,使共轭结构延长从而使发射波长增加,且引入硫原子后可与酶形成二硫键使其结合的更加牢固,可使发光强度明显增强;相较于C-6位,在C-8位进行修饰改造可得到发光特性显著提升的底物;若取代基上连有氢键供体或受体的基团,也可使发光特性发生显著变化。综上所述,我们以NanoLuc生物发光体系为基础,从小分子结构入手,修饰改造底物furimazine的C-6和C-8位置,得到了 A、B两个系列的新型化合物,并在体外水平、体内水平以及萤光素酶选择性方面对化合物进行了系统的活性评价,得到了一些发光更强、持续时间延长、发射波长红移、适用于体内成像的可替代的底物,这些新型化合物将有助于NanoLuc生物发光体系更好的应用于发光成像研究相关领域。除此之外,我们可运用前药的原理将furimazine的3位羰基与特定的识别基团相连接,不仅可以提高furimazine及其类似物的稳定性还可以做成高灵敏度和选择性的探针。希望我们研究所获得的化合物有助于拓宽NanoLuc生物发光体系应用领域,并为以后的进一步优化提供借鉴意义。