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[研究背景和目的]
TPP1基因位于常染色体11p15，编码563个氨基酸组成的三基肽肽酶1(Tripeptidyl-peptidase1，TPP1)。其蛋白结构域主要包括信号肽(Met1-Cys19)、前片段区(Ser20-Ser180)、催化区域(His197-Pro563)，以及连接前片段区与催化区域的连接域(Ser181-Leu196 )，其中催化区域又包括钙离子结合位点(Asp517-Asp543)。TPP1在溶酶体酸性环境中可自动裂解为有活性的TPP1蛋白酶，其能特异地降解寡肽及蛋白质的N-末端并释放出三肽。TPP1基因不同类型的突变可影响TPP1前体蛋白自身加工过程及破坏其蛋白功能域结构，TPP1酶活性明显受损至一定程度可引起神经细胞功能障碍，主要导致晚发婴儿型神经元蜡样质脂褐素沉积症(late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis, LINCL)，但具体致病机制尚未清楚，主要认为是TPP1基因突变导致TPP1酶活性缺失，造成线粒体ATP合成酶的Subunitc在溶酶体内堆积，产生临床症状。随后还发现TPP1基因突变也可以导致一种罕见的退行性疾病——常染色体隐性遗传脊髓小脑性共济失调7型(Autosomal Recessive spinocerebellar ataxia 7，SCAR7)。
LINCL是神经元蜡样质脂褐素沉积症(NCLs)的一种常见类型，为常染色体隐性遗传疾病。典型临床表现为患儿2-4岁出现癫痫发作，随后出现智力减退、运动及语言发育障碍、共济失调以及视力逐渐减退等症状，通常在儿童中期死亡。SCAR7主要表现为儿童期或者青少年期发病，出现小脑性共济失调、锥体束征、小脑萎缩等临床症状，病情较前，病程可延缓至60岁左右。相比LINCL患者，SCAR7患者也出现共济失调，但未见癫痫发作和视觉减退，且超微结构较少见，偶可见GROD或者指纹条纹，酶活性降低而非丧失。2013年YuSun等研究发现，LINCL患者TPP1酶活性缺失，而SCAR7的TPP1酶活性降低，由此，推测TPP1突变导致酶活性损害的程度与表型相关。不同TPP1基因突变导致的酶活性改变值得研究。不同突变位点导致酶活性缺失的机制是否一致？前期MariuszWalus等已经明确了催化区域中Ser475,Glu272,Asp276,Asp327和Asp360与催化结构相关，参与酶活性催化机制。在TPP1基因的催化区域是否还存在与酶活性相关的其它位点呢？本研究将探讨TPP1不同突变对酶活性功能的影响及可能作用机制，明确突变的致病性。
[实验方法]
1、转染TPP1野生型及其蛋白突变体(D276V、S475L、A453D、V216M、V466G和c.1551+1G＞A)重组表达质粒到CHO细胞，48h后提取总蛋白进行Westernblot检测TPP1表达和荧光底物法方法分析酶活性。构建YFP融合表达的TPP1野生型及其蛋白突变体重组表达质粒，将带YFP标签的TPP1野生型及其突变体分别与LAMP1-RFP及ER-ECFP转染到CHO细胞，48h后共聚焦显微镜观察TPP1野生型及其蛋白突变体的亚细胞定位。
[研究结果]
1、生物信息学预测6个突变位点均高度保守，均有致病性。
2、酶活性研究发现6个突变体酶活性显著下降，且与野生型间均有明显差异，差异有统计学意义(P＜0.05)。但各不同位点突变体之间无显著性差异。
3、TPP1蛋白与内参的半定量分析发现：D276V、S475L错义突变体与野生型TPP1蛋白表达量未见明显差异；而V216M、A453D、V466G、c.1551+1G＞A突变体总蛋白表达水平均显著低于TPP1野生型，差异有统计学意义(P＜0.05)，且均未见成熟TPP1蛋白条带。
4、共聚焦显微镜结果显示：带YFP标签的TPP1野生型与D276V、S475L错义突变体大部分与溶酶体蛋白LAMP1-RFP定位，主要分布在溶酶体；而V216M、A453D、V466G和c.1551+1G＞A突变体均较少溶酶体定位，主要滞留在内质网。
[结论]
1、所选6个TPP1突变均导致酶活性障碍，结合生物信息学结果和临床表型，证实为致病性突变。
2、不同位点突变导致酶活性障碍的机制不同。V216M、A453D、V466G、c.1551+1G＞A突变体影响前体蛋白的加工和分泌成熟蛋白；而D276V、S475L突变体可能涉及催化机制。
TPP1基因位于常染色体11p15，编码563个氨基酸组成的三基肽肽酶1(Tripeptidyl-peptidase1，TPP1)。其蛋白结构域主要包括信号肽(Met1-Cys19)、前片段区(Ser20-Ser180)、催化区域(His197-Pro563)，以及连接前片段区与催化区域的连接域(Ser181-Leu196 )，其中催化区域又包括钙离子结合位点(Asp517-Asp543)。TPP1在溶酶体酸性环境中可自动裂解为有活性的TPP1蛋白酶，其能特异地降解寡肽及蛋白质的N-末端并释放出三肽。TPP1基因不同类型的突变可影响TPP1前体蛋白自身加工过程及破坏其蛋白功能域结构，TPP1酶活性明显受损至一定程度可引起神经细胞功能障碍，主要导致晚发婴儿型神经元蜡样质脂褐素沉积症(late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis, LINCL)，但具体致病机制尚未清楚，主要认为是TPP1基因突变导致TPP1酶活性缺失，造成线粒体ATP合成酶的Subunitc在溶酶体内堆积，产生临床症状。随后还发现TPP1基因突变也可以导致一种罕见的退行性疾病——常染色体隐性遗传脊髓小脑性共济失调7型(Autosomal Recessive spinocerebellar ataxia 7，SCAR7)。
LINCL是神经元蜡样质脂褐素沉积症(NCLs)的一种常见类型，为常染色体隐性遗传疾病。典型临床表现为患儿2-4岁出现癫痫发作，随后出现智力减退、运动及语言发育障碍、共济失调以及视力逐渐减退等症状，通常在儿童中期死亡。SCAR7主要表现为儿童期或者青少年期发病，出现小脑性共济失调、锥体束征、小脑萎缩等临床症状，病情较前，病程可延缓至60岁左右。相比LINCL患者，SCAR7患者也出现共济失调，但未见癫痫发作和视觉减退，且超微结构较少见，偶可见GROD或者指纹条纹，酶活性降低而非丧失。2013年YuSun等研究发现，LINCL患者TPP1酶活性缺失，而SCAR7的TPP1酶活性降低，由此，推测TPP1突变导致酶活性损害的程度与表型相关。不同TPP1基因突变导致的酶活性改变值得研究。不同突变位点导致酶活性缺失的机制是否一致？前期MariuszWalus等已经明确了催化区域中Ser475,Glu272,Asp276,Asp327和Asp360与催化结构相关，参与酶活性催化机制。在TPP1基因的催化区域是否还存在与酶活性相关的其它位点呢？本研究将探讨TPP1不同突变对酶活性功能的影响及可能作用机制，明确突变的致病性。
[实验方法]
1、转染TPP1野生型及其蛋白突变体(D276V、S475L、A453D、V216M、V466G和c.1551+1G＞A)重组表达质粒到CHO细胞，48h后提取总蛋白进行Westernblot检测TPP1表达和荧光底物法方法分析酶活性。构建YFP融合表达的TPP1野生型及其蛋白突变体重组表达质粒，将带YFP标签的TPP1野生型及其突变体分别与LAMP1-RFP及ER-ECFP转染到CHO细胞，48h后共聚焦显微镜观察TPP1野生型及其蛋白突变体的亚细胞定位。
[研究结果]
1、生物信息学预测6个突变位点均高度保守，均有致病性。
2、酶活性研究发现6个突变体酶活性显著下降，且与野生型间均有明显差异，差异有统计学意义(P＜0.05)。但各不同位点突变体之间无显著性差异。
3、TPP1蛋白与内参的半定量分析发现：D276V、S475L错义突变体与野生型TPP1蛋白表达量未见明显差异；而V216M、A453D、V466G、c.1551+1G＞A突变体总蛋白表达水平均显著低于TPP1野生型，差异有统计学意义(P＜0.05)，且均未见成熟TPP1蛋白条带。
4、共聚焦显微镜结果显示：带YFP标签的TPP1野生型与D276V、S475L错义突变体大部分与溶酶体蛋白LAMP1-RFP定位，主要分布在溶酶体；而V216M、A453D、V466G和c.1551+1G＞A突变体均较少溶酶体定位，主要滞留在内质网。
[结论]
1、所选6个TPP1突变均导致酶活性障碍，结合生物信息学结果和临床表型，证实为致病性突变。
2、不同位点突变导致酶活性障碍的机制不同。V216M、A453D、V466G、c.1551+1G＞A突变体影响前体蛋白的加工和分泌成熟蛋白；而D276V、S475L突变体可能涉及催化机制。