耐冷微生物分布广泛,是在极地、深海以及冷藏储存等多种低温环境中重要的生物类群。它们在低温下仍然具有高效的物质吸收和转化能力,因此对低温环境中的能量与物质循环起着至关重要的作用,并且拥有很强的生物技术应用价值。耐冷微生物为适应低温环境,在细胞内储存了大量能量物质,对它们的研究可以为新型生物能源的开发利用提供理论依据,而通过与常温菌比较,更能解释它们适应低温的耐冷机制。本课题主要从耐冷菌莓实假单胞菌(Pseudomonas fragi)A22和B25两株同种菌展开,菌株A22在其细胞壁上可以积累一种特有的大颗粒物质A22B,并且胞外脂多糖含量与菌株B25相比高出八倍。前期研究试图分析A22B的物理性质,初步推断是一种聚酯类物质,然而随着研究的展开,关于化学结构的解析和合成途径的探索也遇到了瓶颈。B25是和A22同种的模式菌株,不产生大颗粒物质A22B,脂多糖含量也较少。本课题通过测序绘制两株菌的基因组精细图,随后进行比较基因组学的分析,有助于发现A22B的合成相关基因。另外,通过与常温假单胞菌的比较,能揭示莓实假单胞菌的耐冷机制。1.通过第二代测序技术,对两株莓实假单胞菌进行了测序、拼接和注释,首次得到了莓实假单胞菌的基因组精细图谱。A22染色体基因组全长5,070,897 bp,预测出有功能的基因3818个。B25染色体基因组全长5,020,398 bp,预测出有功能的基因3856个。另外,对于基因组的基本组成元件进行了预测,并且对预测的功能基因和蛋白进行了聚类分析、代谢通路预测等分析。2.通过比较两株菌的基因组结构,发现A22和B25的基因组共线性非常高,插入和缺失的片段相对较少,而存在少量重排。A22的基因组元件中,特有两个编码脂多糖的基因岛,在B25中没有发现。A22含有串联重复序列197条,远超B25所含有的数目(37条),插入序列家族预测显示A22也多于B25,A22基因组移动元件多于B25,推测与A22所生长的低温环境有关,过多的插入和重复序列,能够赋予A22灵活多变的适应能力。莓实假单胞菌的种内功能基因比较发现,A22含有更多元的碳源和氮源利用的相关基因,增强了 A22的适应能力。另一方面,通过和假单胞菌属内另外三株菌的比较发现(P.putida KT2440,P.syringa B728a,P.protegensPf-5),莓实假单胞菌基因组中参与代谢和脂类合成运输的基因比例较大,推测这与耐冷菌在低温环境的自我保护能相关。另外,通过基因和蛋白聚类分析,发现了若干莓实假单胞菌特有的增强低温环境适应性的基因簇和低温诱导调控因子,增进了对于耐冷菌耐寒机制的认识。3.首次报道了来自莓实假单胞菌的内源质粒,通过质粒提取发现A22含有3个天然质粒(pPF01、pPF02和pPF03),B25含有一个质粒(pB25),通过亚克隆测序的到了质粒的序列,并进行基因预测和注释,结合体内试验,验证出A22三个质粒的复制蛋白Rep的功能,并且缩短了其复制元件,为构建穿梭质粒奠定基础。通过序列比较发现,A22的pPF02和B25的pB25质粒非常相似,推测可能是属于莓实假单胞菌中较为古老的质粒。通过对天然质粒中可能存在的质粒稳定元件进行克隆和功能验证,发现只有pPF02中orf5-parE有助于维持质粒的稳定。最后,构建了三个穿梭载体,遗传稳定,拷贝数较高。通过质粒消除实验,筛选出一株消除了pB25的B25M菌株。结合穿梭质粒和B25M,可以为后续研究A22基因组中特有的基因的功能提供便捷工具。