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目的：
通过体外细胞实验研究筛选出相应的药物浓度，确立合适的健脾和胃法代表方六君子汤与顺铂联合用药方案，并观察其对EC9706细胞糖酵解速率及线粒体呼吸能力的影响及相关蛋白P-AMPK、AMPK、P-mTOR、mTOR蛋白表达的调控，基于AMPK/mTOR信号通路探讨六君子汤增强EC9706细胞增强化疗药顺铂的疗效机理，为健脾和胃法在对食管癌临床治疗提供依据。
方法：
1.采用MTT比色法分别筛选六君子汤的乙酸乙酯提取物，顺铂的相应浓度及两者联合用药方案。
2.采用能量代谢分析系统检测各实验组(包括药物单独、同时用药及序贯用药组)对EC9706细胞糖酵解速率的影响。
3.采用能量代谢分析系统检测各实验组(包括药物单独、同时用药及序贯用药组)对EC9706细胞线粒体压力的影响。
4.WesternBlot法检测乙酸乙酯提取的六君子汤、顺铂、二者联合对EC9706细胞P-AMPK、AMPK、P-mTOR、mTOR蛋白表达的影响。
结果：
1.MTT比色法结果显示：不同浓度的六君子汤乙酸乙酯部位提取物对EC9706细胞表现为抑制作用，有明显量效关系，为51.691μg/mL(下限为38.211μg/mL，上限为64.205μg/mL)，IC50为88.754μg/mL(下限为71.988μg/mL，上限为111.982μg/mL)。不同浓度的顺铂对EC9706细胞表现为抑制作用，有明显量效关系，IC30为0.891μg/mL(下限为0.193μg/mL，上限为1.497μg/mL)，IC50为2.020μg/mL(下限为1.041μg/mL，上限为3.101μg/mL)。顺铂2μg/mL与六君子汤100μg/mL同时用药组抑制作用比顺铂2μg/mL组强，(P＜0.05)。
2．能量代谢分析系统的结果显示：六君子汤乙酸乙酯部位能够降低EC9706细胞的糖酵解能力，且其抑制能力随药物浓度升高而增强。其中100μg/mL的六君子汤与空白对照组相比有显著性，(P＜0.05)；顺铂2μg/mL与六君子汤100μg/mL同时用药组能降低EC9706细胞的糖酵解能力，且与空白对照组及2μg/mL顺铂相比均有显著性，(P＜0.05)。
3.能量代谢分析系统结果显示：六君子汤乙酸乙酯部位能够抑制EC9706细胞的线粒体呼吸能力，且其抑制能力随药物浓度升高而增强。其中100μg/mL的六君子汤与空白对照组相比有显著性，(P＜0.05)；同时用药组能降低EC9706细胞的线粒体呼吸能力，与空白对照及相应的顺铂相比均有显著性，(P＜0.05)；序贯用药组能降低线粒体呼吸能力，与空白对照组及相应的顺铂相比有显著性，(P＜0.05)。
4.WesternBlot结果显示：各实验组均能上调P-AMPK、AMPK的表达及P-AMPK/AMPK，但同时用药组及序贯用药组均未表现出协同作用，(P＞0.05)。各实验组均能下调P-mTOR、mTOR的表达及P-mTOR/mTOR，但同时用药组及序贯用药组均未表现出协同作用。(P＞0.05)。
结论
1.六君子汤与顺铂在抑制EC9706细胞活性方面，有一定增效作用。
2.健脾和胃法代表方六君子汤在调节EC9706能量代谢方面有优势，与顺铂联合使用可以增强顺铂对EC9706细胞能量代谢的影响。六君子汤调节EC9706的能量代谢可能是以AMPK为主要靶点。顺铂对肿瘤的抑制作用可能与AMPK、mTOR介导的能量代谢以外的其它环节有关。
3.六君子汤增加顺铂对EC9706细胞抑制作用的机制与AMPK介导的能量代谢有关。
通过体外细胞实验研究筛选出相应的药物浓度，确立合适的健脾和胃法代表方六君子汤与顺铂联合用药方案，并观察其对EC9706细胞糖酵解速率及线粒体呼吸能力的影响及相关蛋白P-AMPK、AMPK、P-mTOR、mTOR蛋白表达的调控，基于AMPK/mTOR信号通路探讨六君子汤增强EC9706细胞增强化疗药顺铂的疗效机理，为健脾和胃法在对食管癌临床治疗提供依据。
方法：
1.采用MTT比色法分别筛选六君子汤的乙酸乙酯提取物，顺铂的相应浓度及两者联合用药方案。
2.采用能量代谢分析系统检测各实验组(包括药物单独、同时用药及序贯用药组)对EC9706细胞糖酵解速率的影响。
3.采用能量代谢分析系统检测各实验组(包括药物单独、同时用药及序贯用药组)对EC9706细胞线粒体压力的影响。
4.WesternBlot法检测乙酸乙酯提取的六君子汤、顺铂、二者联合对EC9706细胞P-AMPK、AMPK、P-mTOR、mTOR蛋白表达的影响。
结果：
1.MTT比色法结果显示：不同浓度的六君子汤乙酸乙酯部位提取物对EC9706细胞表现为抑制作用，有明显量效关系，为51.691μg/mL(下限为38.211μg/mL，上限为64.205μg/mL)，IC50为88.754μg/mL(下限为71.988μg/mL，上限为111.982μg/mL)。不同浓度的顺铂对EC9706细胞表现为抑制作用，有明显量效关系，IC30为0.891μg/mL(下限为0.193μg/mL，上限为1.497μg/mL)，IC50为2.020μg/mL(下限为1.041μg/mL，上限为3.101μg/mL)。顺铂2μg/mL与六君子汤100μg/mL同时用药组抑制作用比顺铂2μg/mL组强，(P＜0.05)。
2．能量代谢分析系统的结果显示：六君子汤乙酸乙酯部位能够降低EC9706细胞的糖酵解能力，且其抑制能力随药物浓度升高而增强。其中100μg/mL的六君子汤与空白对照组相比有显著性，(P＜0.05)；顺铂2μg/mL与六君子汤100μg/mL同时用药组能降低EC9706细胞的糖酵解能力，且与空白对照组及2μg/mL顺铂相比均有显著性，(P＜0.05)。
3.能量代谢分析系统结果显示：六君子汤乙酸乙酯部位能够抑制EC9706细胞的线粒体呼吸能力，且其抑制能力随药物浓度升高而增强。其中100μg/mL的六君子汤与空白对照组相比有显著性，(P＜0.05)；同时用药组能降低EC9706细胞的线粒体呼吸能力，与空白对照及相应的顺铂相比均有显著性，(P＜0.05)；序贯用药组能降低线粒体呼吸能力，与空白对照组及相应的顺铂相比有显著性，(P＜0.05)。
4.WesternBlot结果显示：各实验组均能上调P-AMPK、AMPK的表达及P-AMPK/AMPK，但同时用药组及序贯用药组均未表现出协同作用，(P＞0.05)。各实验组均能下调P-mTOR、mTOR的表达及P-mTOR/mTOR，但同时用药组及序贯用药组均未表现出协同作用。(P＞0.05)。
结论
1.六君子汤与顺铂在抑制EC9706细胞活性方面，有一定增效作用。
2.健脾和胃法代表方六君子汤在调节EC9706能量代谢方面有优势，与顺铂联合使用可以增强顺铂对EC9706细胞能量代谢的影响。六君子汤调节EC9706的能量代谢可能是以AMPK为主要靶点。顺铂对肿瘤的抑制作用可能与AMPK、mTOR介导的能量代谢以外的其它环节有关。
3.六君子汤增加顺铂对EC9706细胞抑制作用的机制与AMPK介导的能量代谢有关。