结直肠癌致死率和发病率呈现逐年上升趋势,是人类第三大恶性肿瘤。除了传统的手术及放化疗手段,基于肿瘤新生抗原的个体化肿瘤疫苗是新兴的抗肿瘤疗法。肿瘤新抗原源自体细胞突变,由于其在正常组织中不表达而具有肿瘤特异性。目前国内外针对结肠癌新抗原的研究相对较少。相比当前癌症研究的临床前免疫缺陷小鼠模型,斑马鱼(Danio rerio)具有与人类基因组高同源、短周期、高通量、体内动态可视、发育前期无适应性免疫、以及低成本等优势,逐渐发展成另一相对快速且具有较高成本效益的人类癌症体内模型。据此,本研究旨在构建简便有效的筛选及鉴定结肠癌新抗原的新平台,并期望应用该模型获得候选靶点抗原。我们依赖于斑马鱼异种移植的能力来揭示效靶细胞在其体内的免疫原性及杀伤活性,因此我们(1)构建斑马鱼移植瘤模型,将CM-Dil标记的T2-A24细胞显微注射入受精后2天(days post fertilization,dpf)的斑马鱼体内,培养4天,发现T2-A24细胞具有在斑马鱼体内增殖的能力;(2)为了确定合适的效靶细胞比例,显微注射CM-Dil标记的不同数量外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)于2 dpf斑马鱼中,连续培养,发现PBMC在斑马鱼体内稳定存在,并确定了效靶细胞比为2.5:1;(3)采集HLA-A*24:02分型健康志愿者外周血,分离PBMC,添加IL-2和AKF9(文献中已报道并经我们再次验证能与HLA-A*24:02分子强结合的多肽),共培养12天后,与负载AKF9的T2-A24靶细胞在同一天/隔天显微注射入2 dpf斑马鱼中,建立斑马鱼效靶细胞同时/分开注射免疫干预模型,培养3天,发现相比效靶细胞分开注射约40%的杀伤效率,效靶细胞同时注射杀伤效率更高,为50%左右;(4)基于我们实验室前期对TCGA数据库中结肠癌样本以及20例临床结肠癌患者外周血、癌旁组织和癌组织外显子组与转录组测序数据的新抗原预测分析,我们挑选、设计和合成了40对HLA-A*24:02和12对HLA-A*02:01限制性抗原肽,利用T2-Binding、ELIspot、LDH等实验验证体外免疫原性,选出了免疫原性较好的3对HLA-A*24:02和2对HLA-A*02:01限制性抗原肽;(5)针对上述5对具有代表性的抗原肽,我们构建效靶细胞同时注射斑马鱼模型,验证其在体内的杀伤活性,发现其中2对抗原肽如3-6和5-6,相比其野生型,突变肽能够诱导T细胞活化并杀伤负载相应抗原的靶细胞,提示我们这些新抗原具有一定的体内免疫原性。综上,本研究首次成功建立了用于鉴定新抗原免疫原性和杀伤活性的斑马鱼移植瘤免疫干预模型,其有望成为免疫原性验证新平台。同时我们首次将其应用于结肠癌新抗原肽的筛选研究中,为治疗性疫苗和细胞治疗提供了新的候选靶点抗原。