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糖尿病(Diabetes mellitus,DM)在WHO发布的常见50种疾病死亡病因中位居第9位。近年来,我国DM的发病率逐年增高,糖尿病肾病(Diabetic nephropathy,DN)是DM常见和严重的微血管并发症之一,其发病率也逐年升高。DN患者有三分之一可发展为终末期肾衰。
DN时在高血糖、糖基化终产物、肾素-血管紧张素系统、氧化应激、内皮素(ET)等因素影响下,肾脏TGF-β1的分泌增加,RGF-β1与其受体(RⅠ/RⅡ)结合,导致受体型Smad3的激活,TGF-β1/smad信号通路可通过介导足细胞损伤、系膜细胞增生,小管细胞肥大、促进细胞外基质的产生、抑制细胞外基质的降解、基底膜增厚、上皮细胞-间充质转化,肾细胞凋亡最终导致肾小球硬化及肾间质纤维化。Smad7属于抑制型Smad家族成员,它对TGF-β1/smad通路起负向调控作用。核因子-KappaB(nuclearfactor-KappaB,NF-κB)是一种多靶向重要的核转录因子,广泛存在于各种细胞中,它参与细胞内的信号传递,调控多种基因的表达,具有抑制细胞凋亡作用和促进细胞凋亡的双向作用。DN时Smad7可抑制足细胞凋亡因子NF-κB的活性.
中医“肾痿”假说是导师赵宗江教授根据多年的肾病的诊疗经验,参照大量古代文献和现代医学的相关知识,提出的糖尿病肾病的新理论,是对中医痿证理论的创新和发展。“肾痿”是指肾体痿弱不用,临床以尿浊为主症的慢性虚损性肾脏疾病,病因为久病损肾；其发病机理主要是热在下、肾气、阴和阳虚,总缘肾脏虚损,精气严重耗伤,以致肾体受损甚至萎废不用。糖肾宁胶囊是导师根据“肾痿”理论指导所拟治疗DN的组方,具有温肾健脾、解毒利水作用,适用于阴阳两虚证、瘀毒内阻证。它对DN“肾痿”有良好的治疗效果。
本实验采用了免疫组化,原位杂交,RT-PCR的实验方法分别从蛋白和基因不同角度对DN大鼠肾脏组织和高糖刺激下足细胞表达FGF-β1、Smad7、NF-κB以及糖肾宁胶囊对其表达的影响作了系统的研究。
目的:
通过建立DN大鼠模型,整体动物实验研究糖肾宁胶囊是否能够有效的改善DN大鼠肾功能,减轻氧化应激反应,延缓肾脏病理损伤,从组织、细胞、蛋白质、基因水平研究糖肾宁胶囊对DN大鼠TGF-β1、Smad7、NF-κB蛋白表达的影响；体外细胞实验研究高糖作用下足细胞TGF-β1、Smad7、NF-κB基因表达的情况,以期阐明糖肾宁胶囊防治DN“肾痿”的作用机制。
方法:
雄性SD大鼠44只,随机分为正常组,模型组,厄贝沙坦组,糖肾宁胶囊组,造模采用腹腔内一次性注射链脲佐菌素STZ复制DN大鼠模型。各组分别给予相应药物或蒸馏水灌胃治疗；观察大鼠的精神状态、体重、体毛、饮水量、二便及活动情况等；实验2,4,6,8,10,12周测量大鼠体重,12周取出大鼠肾脏,称重后计算肾重体重比；实验4,8,12周用代谢笼收集24h尿液,记录尿量,用考马斯亮蓝法测24h尿蛋白定量；检测血清TG、BUN、Scr、NO、MDA、SOD含量；HE,六胺银,Masson,Mallory染色观察大鼠肾脏病理学变化.同时采用病理评分标准评价各组大鼠肾组织病理改变；免疫组织化学,原位杂交,RT-PCR分别检测DN大鼠肾组织和高糖刺激下肾小球脏层上皮细胞足细胞TGF-β1、Smad7、NF-κB蛋白和mRNA表达情况.
结果:
糖肾宁胶囊防治糖尿病肾病大鼠药效学与机制在于①体重:与模型组比较糖肾宁胶囊治疗组大鼠体重各周均有所增加,在第十二周时,糖肾宁胶囊组大鼠的体重与模型组比较有极显著差异(P<0.01).②肾重/体重比:与模型组比,糖肾宁胶囊治疗组大鼠肾重/体重比减轻明显,有显著性差异(P<0.05).③24h尿蛋白定量:与模型组比较,糖肾宁胶囊干预后第4周以及第8周,24h尿蛋白排泄量均显著减少(P<0.01),第12周减少(P<0.05).④血脂:糖肾宁胶囊组可以降低DN大鼠血清中TG水平,纠正脂质代谢紊乱(P<0.05)。⑤肾功能:糖肾宁胶囊可以改善DN大鼠肾功能,降低血清BUN(P<0.05)和Scr(P<0.01)。⑥氧化应激:糖肾宁胶囊可以升高DN大鼠血清NO水平,与模型组比较有显著差异(P<0.01)；降低DN大鼠血清MDA水平,较模型组有极显著差(P<0.01)；升高血清SOD含量,较模型组有极显著差异(P<0.01)。⑦TGF-β1-Smad7-NF-κB信号转导通路:糖肾宁胶囊可以降低DM大鼠肾组织TGF-β1蛋白及mRNA,NF-κB蛋白,上调Smad7蛋白的表达；降低高糖刺激下的肾小球足细胞TGF-β1、NF-βBmRNA,上调Smad7mRNA的表达。
结论:
糖肾宁胶囊治疗DN大鼠“肾痿”的机制可能在于能显著改善DN大鼠的一般状况、降低DN大鼠肾重/体重比；降低血肌酐及尿素氮；减轻24h尿蛋白排泄量,减轻DN大鼠肾脏病理学改变以及减轻DN大鼠氧化应激反应。下调肾组织TGF-β1、NF-κB蛋白上调Smad7蛋白的表达。抑制高糖刺激下的足细胞TGF-β1、NF-κBmRNA的表达,上调Smad7mRNA的表达,作用于DN时TGF-β1-Smad7-NF-κB信号转导通路,从而降低足细胞的凋亡,减少蛋白尿的产生。
DN时在高血糖、糖基化终产物、肾素-血管紧张素系统、氧化应激、内皮素(ET)等因素影响下,肾脏TGF-β1的分泌增加,RGF-β1与其受体(RⅠ/RⅡ)结合,导致受体型Smad3的激活,TGF-β1/smad信号通路可通过介导足细胞损伤、系膜细胞增生,小管细胞肥大、促进细胞外基质的产生、抑制细胞外基质的降解、基底膜增厚、上皮细胞-间充质转化,肾细胞凋亡最终导致肾小球硬化及肾间质纤维化。Smad7属于抑制型Smad家族成员,它对TGF-β1/smad通路起负向调控作用。核因子-KappaB(nuclearfactor-KappaB,NF-κB)是一种多靶向重要的核转录因子,广泛存在于各种细胞中,它参与细胞内的信号传递,调控多种基因的表达,具有抑制细胞凋亡作用和促进细胞凋亡的双向作用。DN时Smad7可抑制足细胞凋亡因子NF-κB的活性.
中医“肾痿”假说是导师赵宗江教授根据多年的肾病的诊疗经验,参照大量古代文献和现代医学的相关知识,提出的糖尿病肾病的新理论,是对中医痿证理论的创新和发展。“肾痿”是指肾体痿弱不用,临床以尿浊为主症的慢性虚损性肾脏疾病,病因为久病损肾；其发病机理主要是热在下、肾气、阴和阳虚,总缘肾脏虚损,精气严重耗伤,以致肾体受损甚至萎废不用。糖肾宁胶囊是导师根据“肾痿”理论指导所拟治疗DN的组方,具有温肾健脾、解毒利水作用,适用于阴阳两虚证、瘀毒内阻证。它对DN“肾痿”有良好的治疗效果。
本实验采用了免疫组化,原位杂交,RT-PCR的实验方法分别从蛋白和基因不同角度对DN大鼠肾脏组织和高糖刺激下足细胞表达FGF-β1、Smad7、NF-κB以及糖肾宁胶囊对其表达的影响作了系统的研究。
目的:
通过建立DN大鼠模型,整体动物实验研究糖肾宁胶囊是否能够有效的改善DN大鼠肾功能,减轻氧化应激反应,延缓肾脏病理损伤,从组织、细胞、蛋白质、基因水平研究糖肾宁胶囊对DN大鼠TGF-β1、Smad7、NF-κB蛋白表达的影响；体外细胞实验研究高糖作用下足细胞TGF-β1、Smad7、NF-κB基因表达的情况,以期阐明糖肾宁胶囊防治DN“肾痿”的作用机制。
方法:
雄性SD大鼠44只,随机分为正常组,模型组,厄贝沙坦组,糖肾宁胶囊组,造模采用腹腔内一次性注射链脲佐菌素STZ复制DN大鼠模型。各组分别给予相应药物或蒸馏水灌胃治疗；观察大鼠的精神状态、体重、体毛、饮水量、二便及活动情况等；实验2,4,6,8,10,12周测量大鼠体重,12周取出大鼠肾脏,称重后计算肾重体重比；实验4,8,12周用代谢笼收集24h尿液,记录尿量,用考马斯亮蓝法测24h尿蛋白定量；检测血清TG、BUN、Scr、NO、MDA、SOD含量；HE,六胺银,Masson,Mallory染色观察大鼠肾脏病理学变化.同时采用病理评分标准评价各组大鼠肾组织病理改变；免疫组织化学,原位杂交,RT-PCR分别检测DN大鼠肾组织和高糖刺激下肾小球脏层上皮细胞足细胞TGF-β1、Smad7、NF-κB蛋白和mRNA表达情况.
结果:
糖肾宁胶囊防治糖尿病肾病大鼠药效学与机制在于①体重:与模型组比较糖肾宁胶囊治疗组大鼠体重各周均有所增加,在第十二周时,糖肾宁胶囊组大鼠的体重与模型组比较有极显著差异(P<0.01).②肾重/体重比:与模型组比,糖肾宁胶囊治疗组大鼠肾重/体重比减轻明显,有显著性差异(P<0.05).③24h尿蛋白定量:与模型组比较,糖肾宁胶囊干预后第4周以及第8周,24h尿蛋白排泄量均显著减少(P<0.01),第12周减少(P<0.05).④血脂:糖肾宁胶囊组可以降低DN大鼠血清中TG水平,纠正脂质代谢紊乱(P<0.05)。⑤肾功能:糖肾宁胶囊可以改善DN大鼠肾功能,降低血清BUN(P<0.05)和Scr(P<0.01)。⑥氧化应激:糖肾宁胶囊可以升高DN大鼠血清NO水平,与模型组比较有显著差异(P<0.01)；降低DN大鼠血清MDA水平,较模型组有极显著差(P<0.01)；升高血清SOD含量,较模型组有极显著差异(P<0.01)。⑦TGF-β1-Smad7-NF-κB信号转导通路:糖肾宁胶囊可以降低DM大鼠肾组织TGF-β1蛋白及mRNA,NF-κB蛋白,上调Smad7蛋白的表达；降低高糖刺激下的肾小球足细胞TGF-β1、NF-βBmRNA,上调Smad7mRNA的表达。
结论:
糖肾宁胶囊治疗DN大鼠“肾痿”的机制可能在于能显著改善DN大鼠的一般状况、降低DN大鼠肾重/体重比；降低血肌酐及尿素氮；减轻24h尿蛋白排泄量,减轻DN大鼠肾脏病理学改变以及减轻DN大鼠氧化应激反应。下调肾组织TGF-β1、NF-κB蛋白上调Smad7蛋白的表达。抑制高糖刺激下的足细胞TGF-β1、NF-κBmRNA的表达,上调Smad7mRNA的表达,作用于DN时TGF-β1-Smad7-NF-κB信号转导通路,从而降低足细胞的凋亡,减少蛋白尿的产生。