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腈水合酶（NHase,EC 4.2.1.84）是一种重要的工具酶,可催化腈类底物通过水合作用生成相应的酰胺。腈水合酶催化过程具有催化效率高、反应条件温和且无副产物等优势,已成为替代传统化学法实现高附加值酰胺化合物绿色高效合成的重要途径,被广泛用于医药、农药中间体等精细化工领域。目前工业上常利用红球菌、假诺卡氏菌、恶臭假单胞菌等产腈水合酶野生菌为生物催化剂,但面临培养周期长、产酶量少和蛋白纯化困难等缺陷。大肠杆菌表达系统具有培养简便、细胞生长速度快和蛋白表达量高等优势,是腈水合酶异源表达的理想宿主。然而,目前大肠杆菌表达腈水合酶常存在表达量低、包涵体严重等问题。本论文通过基因挖掘,筛选获得来源于泛生菌Pantoea sp.At-9b的腈水合酶NHase Ps,并利用大肠杆菌表达系统实现了其异源特异性表达。通过优化翻译起始区m RNA二级结构的方法,增加了β亚基表达量;通过融合标签蛋白策略优化了α亚基的可溶性表达,成功提高了NHase Ps在大肠杆菌中的表达量及活力,主要研究结果如下:（1）以腈水合酶保守区氨基酸序列为模板,利用基因挖掘法从生物信息数据库中挖掘新型腈水合酶基因,最终筛选获得来源于Rhodococcus fascians A76、Williamsia sterculiae strain CPCC 203464、Amycolatopsis thermoflava、Streptomyces thermoautotrophicus、Pantoea sp.At-9b以及Rhizobiales bacterium YIM 77505的6种腈水合酶基因,并利用大肠杆菌Escherichia.coli BL21（DE3）进行异源表达。考察了重组腈水合酶异源表达水平以及对丙烯酰胺的催化活力,其中来源于Pantoea sp.At-9b的腈水合酶NHase Ps酶活最高,为31 U/mg DCW。利用重组NHase Ps催化丙烯腈合成丙烯酰胺,0.3 g/L DCW在6.5 h内催化合成丙烯酰胺累积达到50g/L。（2）对重组腈水合酶NHase Ps在大肠杆菌中的异源表达进行了优化:首先,优化了α亚基和β亚基之间的linker序列,通过软件“RNAstructure”计算不同linker的最小折叠自由能（minimal folding free energy,ΔG）。自由能越高,其m RNA结构越松散,更容易被核糖体翻译。通过筛选不同的linker序列,优化β亚基基因翻译起始区m RNA二级结构,得到一株最高ΔG值的优化子NHase Ps M2（-16.8kcal/mol）。结果表明,NHase Ps M2酶活最高,活力为160 U/mg DCW。其次,设计多重SD序列优化策略,提高核糖体结合效率。以NHase Ps M2翻译起始区中SD-ATG序列为参考,设计不同组合的多重SD序列,得到最佳优化子NHase Ps M2-2,酶活为270 U/mg DCW。最后,考察了融合标签蛋白对α亚基可溶性表达的影响,通过在α亚基N端融合6种标签蛋白,提高α亚基的可溶性表达,其中PGB1 tag融合标签效果最好,融合标签腈水合酶NHase Ps（PGB1α）不仅使α亚基完全可溶性表达,而且提高了α亚基表达量,酶活达到558 U/mg DCW。（3）对腈水合酶NHase Ps（PGB1α）进行了表达条件优化与酶学性质研究,并考察了全细胞催化丙烯腈合成丙烯酰胺的反应进程。结果表明,在诱导温度为26℃,诱导剂IPTG终浓度为1.0 m M,钴离子浓度为0.2 m M时,重组腈水合酶NHase Ps表达最优;进一步考察了重组腈水合酶的酶学性质,发现其最适反应温度为30℃,最适反应p H为7.0,重组腈水合酶在30℃与40℃下半衰期分别为14 h和3.7 h。考察了重组腈水合酶反应动力学,计算得NHase Ps（PGB1α）、NHase Ps M2-2、NHase Ps的Km值分别为34.74、26.86、18.91 m M,Kcat/Km分别为0.108、0.074、0.067。利用全细胞催化底物丙烯腈,在催化剂用量为3.10 g/L DCW浓度时,产物丙烯酰胺终浓度达202 g/L。