兔病毒性出血症（Rabbit hemorrhagic disease,RHD）,俗称兔瘟,是一种由兔出血症病毒（Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV）引起的急性、致死性及高度接触性传染病,可引起许多不同品种兔发病死亡。兔瘟的危害日渐严重,该病对养兔业造成的非常严重的经济损失,而且严重影响养兔业的健康发展。虽然兔出血症病毒仅仅只有一种血清型,却已经演化出来了多个不同的基因型,导致其致病性与抗原性发生了改变。2020年,我国四川省首次报道国内出现兔出血症病毒2型（RHDV2）。目前,国内尚无用于防控RHDV2的疫苗,且缺乏可以同时抵抗兔出血症病毒1型、2型感染的疫苗。因此,本研究旨在制备出一种安全、高效的,能同时预防两种基因型RHDV的二价疫苗,并对其安全性以及免疫效果进行了评估。本研究将RHDV1 LQ株和RHDV2 JT株分别接种健康易感新西兰兔,并对不同时间收获的病毒组织经研磨灭活后进行了免疫原性比较。根据实验结果,我们以接毒后24～96小时作为组织收获的时间。为筛选最佳灭活条件,将研磨后的组织病毒液分别加入不同浓度的甲醛溶液在37℃进行灭活,并于不同时间取样进行灭活检验,最终确定终浓度0.4%甲醛溶液,在37℃条件下作用48小时为最佳灭活条件。为确定最适病毒液稀释倍数,取病毒组织与稀释液以不同的比例研磨后进行灭活,根据免疫攻毒试验结果确定病毒组织与稀释液的最终稀释比例为1:9。为确定疫苗的最适抗原凝集价,制备的不同凝集价抗原的组织灭活悬液进行免疫攻毒保护实验,结果显示灭活疫苗的配苗抗原凝集价应≥1:256。随后将灭活后的LQ株和JT株病毒组织悬液以不同的比例制成二价灭活疫苗,根据免疫攻毒保护试验,最终确定RHDV1与RHDV2灭活组织悬液的配苗比例为1:1。灭活疫苗经无菌检验、甲醛残留量测定、安全性检验均合格后进行效力检验,结果显示对RHDV1及RHDV2保护率分别可达到100%与90%。本研究以RHDV1的LQ株、RHDV2的JT株为基础,通过对组织收获时间、灭活条件、稀释倍数、抗原配比等方面筛选,研制了兔出血症病毒1型、2型二价组织灭活疫苗。为进一步评价疫苗的安全性及商品化疫苗的要求,进行了灭活疫苗的安全性研究,分别进行单次单剂量、单剂量重复及单次超剂量接种,结果显示接种疫苗后动物的采食、饮水及精神状况均正常且无不良的临床反应,注射部位无红肿、炎症等反应,各组织脏器均无异常病变,表明该疫苗具有良好的安全性。为进一步评价该灭活疫苗的免疫效果进行了相关的实验。最小免疫剂量实验结果表明,该灭活疫苗以不低于0.5 m L/只的剂量接种兔可提供完全保护,因此将最小免疫剂量确定为0.5 m L/只,但为保证临床的免疫保护效果,所以推荐的免疫剂量为1m L/只。血清效价检验与免疫攻毒保护相关性研究结果显示,当RHDV1和RHDV2的HI抗体≥1:32时,可给免疫兔提供保护且保护率高达100%。子代通过母源抗体获得被动免疫力和免疫持续期试验结果显示,母源抗体在仔兔断奶（25日龄左右）前能够提供一定的保护。抗体消涨规律及免疫持续期实验结果显示,免疫21日后抗体水平达到最高,并且在180日后仍然处于较高的抗体水平（1:32）,初步确定灭活疫苗的免疫持续期为6个月。交叉攻毒保护实验结果显示,两者的交叉保护率较低,且不能提供有效的保护。综上所述,本研究研制了兔出血症病毒1型、2型二价组织灭活疫苗,并证实其具有良好的安全性以及免疫效果,该疫苗能够对兔提供良好的免疫保护,为商品化的兔病毒性出血症二价疫苗的研发奠定了基础。