论文部分内容阅读
目的:基于肠道菌群多样性、代谢组学分析及核激素受体探讨茵陈蒿汤及其组分调控代谢相关脂肪性肝病（Metabolicassociatedfattyliverdisease,MAFLD）小鼠胆汁酸、脂肪酸代谢效应机制研究。方法:64只雄性C57BL/6J小鼠随机分为正常小鼠和模型对照小鼠。采用高脂饲料（High Fat Diet,HFD）喂养诱导MAFLD小鼠模型。于造模第8周末日,将模型对照小鼠随机分为模型组、绿原酸组、大黄多糖组、没食子酸组、栀子苷组、组分复方组（绿原酸+大黄多糖+没食子酸+栀子苷）、茵陈蒿汤组。H＆E、油红O染色,观察小鼠肝脏组织病理学变化。常规生化方法检测小鼠血清肝功能、血脂、血糖变化。16S rRNA高通量测序检测小鼠肠道微生物多样性。超高效液相色谱三重四级杆质谱法（UPLC-TQ-MS）定量检测小鼠肠道内容物、血清、肝脏、白色脂肪、棕色脂肪及脑组织代谢物谱。蛋白免疫印迹法检测肝组织胆汁酸转运体BSEP、NTCP、OAPT4a1、MRP3、MRP4,肝组织脂肪代谢相关因子SREBP-1c、ChREBP、FAS、ACC1、CD36、SCD1,肝组织核激素受体FXR/小异源二聚体伴侣SHP及LXR-alpha蛋白表达变化。结果:1.组织病理学结果提示,MAFLD小鼠肝组织出现小泡性肝细胞脂肪变性、汇管区小胆管显著增生、炎性细胞浸润等病理特征。茵陈蒿汤及其组分绿原酸、大黄多糖、没食子酸、栀子苷以及组分复方均能够减轻肝细胞内脂肪变性,改善炎症损伤。其中绿原酸、大黄多糖、栀子苷及组分复方作用更为显著。2.与正常小鼠比较,MAFLD小鼠血清ALT、AST、ALP活性及TBIL、DBIL、TC、TG、LDL-c、FFA含量显著升高,HDL-c含量显著降低（P＜0.05）。茵陈蒿汤及其组分绿原酸、大黄多糖、没食子酸、栀子苷以及组分复方均能够显著降低模型小鼠血清ALT、AST活性以及TC、TG含量,升高HDL-c含量（P＜0.05）;绿原酸、大黄多糖及组分复方能够显著降低模型小鼠血清FFA含量;栀子苷能够显著降低模型小鼠血清FFA、TBIL、DBIL含量。3.与正常小鼠比较,MAFLD小鼠肠道菌群发生显著改变。在属水平上,模型小鼠肠 道 norankfDesulfovibrionaceae、Bacteroides、norankfErysipelotrichaceae、CoriobacteriaceaeUCG002、Eubacteriuncoprostanoligenesgroup、Ruminiclostridium9、Oscillibacter、Faecalibaculum菌属丰度显著升高（P＜0.05）,norankfMuribaculaceae、LachnospiraceaeNK4A136group、norankfLachnospiraceae、Dubosiella、Desulfovibrio菌属丰度显著降低（P＜0.05）。与模型小鼠比较,茵陈蒿汤显著降低模型小鼠肠道Bacteroides、norank f Erysipelotrichaceae菌属丰度（P＜0.05）。绿原酸显著降低模型小鼠肠 道 B acteroides、norankfErysipelotrichaceae、CoriobacteriaceaeUCG-002、Faecalibaculum菌属丰度（P＜0.05）,升高模型小鼠肠道norankfDesulfovibrionaceae、LachnospiraceaeNK4A136group菌属丰度（P＜0.05）。大黄多糖显著降低模型小鼠肠道Bacteroides、norankfErysipelotrichaceae、CoriobacteriaceaeUCG-002、Ruminiclostridium9菌属丰度（P＜0.05）,升高模型小鼠肠道norankfLachnospiraceae菌属丰度（P＜0.05）。没食子酸显著降低模型小鼠肠道norankfErysipelotrichaceae菌属丰度（P＜0.05）。栀子苷显著降低模型小鼠肠道norankfDesulfovibrionaceae、Bacteroides、norankfErysipelotrichaceae、CoriobacteriaceaeUCG-002菌属丰度（P＜0.05）,升高模型小鼠肠道norankfLachnospiraceae菌属丰度（P＜0.05）。组分复方显著降低模型小鼠肠道Bacteroides、norankfErysipelotrichaceae、CoriobacteriaceaeUCG-002、Faecalibaculum菌属丰度（P＜0.05）,升高模型小鼠肠道 LachnospiraceaeNK4A136group、norankfLachnospiraceae菌属丰度（P＜0.05）。在种水平上,与正常小鼠比较,模型小鼠肠道Bacteroidesacidifaciens、Bacteroidesvulgatus、unculturedbacteriumgnorankfDesulfovibrionaceae、unclassifiedgEubacterium]coprostanoligenesgroup、unculturedbacteriumgRuminiclostridium9、unculturedbacteriumgFaecalibaculum、unclassifiedgnorankfErysipelotrichaceae、unculturedbacteriumgCoriobacteriaceaeUCG-002菌种丰度显著升高（P＜0.05）,unculturedB acteroidalesbacteriumgnorankfMuribaculaceae、unclassifiedgLachnospiraceaeNK4A136group、unculturedbacteriumgDubosiella、unculturedbacteriumgnorankfMuribaculaceae、unculturedbacteriumgDesulfovibrio、unculturedbacteriumgLachnospiraceaeNK4A136group菌种丰度显著降低（P＜0.05）。与模型小鼠比较,茵陈蒿汤显著降低模型小鼠肠道Bacteroidesvulgatus、unclassifiedgnorankfErysipelotrichaceae菌种丰度（P＜0.05）。绿原酸显著降低模型小鼠肠道Bacteroidesvulgatus、unculturedbacteriumgCoriobacteriaceaeUCG-002、unculturedbacteriumgFaecalibaculum、unclassifiedgnorankfErysipelotrichaceae菌种丰度（P＜0.05）,升高模型小鼠肠道unculturedbacteriumgnorankfMuribaculaceae菌种丰度（P＜0.05）。大黄多糖显著降低模型小鼠肠道Bacteroidesacidifaciens、Bacteroidesvulgatus、unculturedbacteriumgRuminiclostridium9、unclassifiedgnorankfErysipelotrichaceae、unculturedbacteriumgCoriobacteriaceaeUCG-002菌种丰度（P＜0.05）,升高模型小鼠肠道unculturedbacteriumgnorankfMuribaculaceae菌种丰度（P＜0.05）。没食子酸显著降低模型小鼠肠道Bacteroidesvulgatus、unclassifiedgnorankfErysipelotrichaceae菌种丰度（P＜0.05）,升高模型小鼠肠道Bacteroidessartorii菌种丰度（P＜0.05）。栀子苷显著降低模型小鼠肠道Bacteroidesvulgatus、unculturedbacteriumgnorankfDesulfovibrionaceae、unclas sifiedgnorankfEry sipelotrichaceae、unculturedbacteriumgCoriobacteriaceaeUCG-002菌种丰度（P＜0.05）。组分复方显著降低模型小鼠肠道Bacteroidesvulgatus、unculturedbacteriumgFaecalibaculum、unclas sifiedgnorankfEry sipelotrichaceae、unculturedbacteriumgCoriobacteriaceaeUCG-002菌种丰度（P＜0.05）,升高模型小鼠肠道unclassifiedgLachnospiraceaeNK4A136group、Bacteroidessartorii菌种丰度（P＜0.05）。4.与正常小鼠比较,模型小鼠48种回肠内容物代谢物（17种脂肪酸、10种胆汁酸、10种有机酸、5种肉碱、4种氨基酸、2种碳水化合物）,66种血清代谢物（26种脂肪酸、1 1种有机酸、10种氨基酸、8种胆汁酸、5种肉碱、3种苯环类化合物、1种碳水化合物、2种苯丙酸）,80种肝组织代谢物（28种脂肪酸、17种氨基酸、13种有机酸、5种胆汁酸、6种肉碱、8种苯环类化合物、2种碳水化合物、1种苯丙酸）,48种白色脂肪代谢物（32种脂肪酸、9种有机酸、3种氨基酸、2种肉碱、1种碳水化合物、1种苯丙酸、0种胆汁酸、0种苯环类化合物）,56种棕色脂肪代谢物（29种脂肪酸、10种氨基酸、9种有机酸、3种碳水化合物、2种胆汁酸、2种肉碱、1种苯环类化合物）,46种脑组织代谢物（19种脂肪酸、8种胆汁酸、5种氨基酸、5种有机酸、4种碳水化合物、2种肉碱、2种苯丙酸、1种苯环类化合物）浓度发生显著改变。与模型小鼠比较,茵陈蒿汤能够显著改善模型小鼠12种回肠内容物代谢物（3种脂肪酸、4种胆汁酸、4种有机酸、1种肉碱）,41种血清代谢物（15种脂肪酸、8种有机酸、6种氨基酸、4种胆汁酸、4种肉碱、1种碳水化合物、1种苯环类化合物、2种苯丙酸）,22种肝组织代谢物（10种脂肪酸、3种胆汁酸、3种有机酸、2种肉碱、3种氨基酸、1种苯环类化合物）,3种白色脂肪代谢物（2种脂肪酸、1种有机酸）,16种棕色脂肪代谢物（7种脂肪酸、4种有机酸、1种肉碱、2种氨基酸、1种碳水化合物、1种苯环类化合物）,12种脑组织代谢物（3种脂肪酸、3种胆汁酸、1种肉碱、1种氨基酸、2种碳水化合物、1种苯环类化合物、1种苯丙酸）浓度。绿原酸能够显著改善模型小鼠14种回肠内容物代谢物（6种有机酸、4种脂肪酸、2种胆汁酸、1种肉碱、1种碳水化合物）,20种血清代谢物（6种脂肪酸、5种氨基酸、4种有机酸、3种肉碱、1种苯环类化合物、1种苯丙酸）,23种肝组织代谢物（6种脂肪酸、7种有机酸、4种氨基酸、1种胆汁酸、1种肉碱、1种碳水化合物、3种苯环类化合物）,16种白色脂肪代谢物（14种脂肪酸、2种有机酸）,14种棕色脂肪代谢物（3种脂肪酸、4种有机酸、2种胆汁酸、2种肉碱、2种氨基酸、1种苯环类化合物）,11种脑组织代谢物（3种碳水化合物、2种脂肪酸、1种胆汁酸、2种有机酸、2种肉碱、1种氨基酸）浓度。大黄多糖能够显著改善模型小鼠14种回肠内容物代谢物（7种脂肪酸、4种胆汁酸、3种有机酸）,9种血清代谢物（3种有机酸、3种氨基酸、1种肉碱、1种苯环类化合物、1种苯丙酸）,24种肝组织代谢物（8种脂肪酸、6种氨基酸、5种有机酸、2种肉碱、3种苯环类化合物）,6种白色脂肪代谢物（5种脂肪酸、1种氨基酸）,16种棕色脂肪代谢物（10种脂肪酸、4种有机酸、1种肉碱、1种氨基酸）,14种脑组织代谢物（5种脂肪酸、2种氨基酸、2种碳水化合物、1种胆汁酸、1种有机酸、1种肉碱、1种苯环类化合物、1种苯丙酸）浓度。没食子酸能够显著改善模型小鼠6种回肠内容物代谢物（3种胆汁酸、3种有机酸）,10种血清代谢物（3种有机酸、2种氨基酸、1种脂肪酸、1种胆汁酸、1种肉碱、1种苯环类化合物、1种苯丙酸）,14种肝组织代谢物（8种脂肪酸、2种胆汁酸、2种氨基酸、1种有机酸、1种肉碱）,1种白色脂肪代谢物（1种脂肪酸）,13种棕色脂肪代谢物（7种脂肪酸、4种氨基酸、1种有机酸、1种碳水化合物）,13种脑组织代谢物（6种脂肪酸、2种胆汁酸、3种碳水化合物、1种肉碱、1种氨基酸）浓度。栀子苷能够显著改善模型小鼠19种回肠内容物代谢物（6种胆汁酸、5种有机酸、4种脂肪酸、2种氨基酸、1种肉碱、1种碳水化合物）,46种血清代谢物（22种脂肪酸、8种有机酸、5种氨基酸、3种胆汁酸、3种肉碱、1种碳水化合物、2种苯环类化合物、2种苯丙酸）,20种肝组织代谢物（10种脂肪酸、4种胆汁酸、1种有机酸、2种肉碱、3种氨基酸）,2种白色脂肪代谢物（2种脂肪酸）,16种棕色脂肪代谢物（9种脂肪酸、2种有机酸、4种氨基酸、1种肉碱）,15种脑组织代谢物（5种脂肪酸、4种碳水化合物、2种胆汁酸、2种氨基酸、1种肉碱、1种苯环类化合物）浓度。组分复方能够显著改善模型小鼠15种回肠内容物代谢物（5种有机酸、4种胆汁酸、3种脂肪酸、1种肉碱、1种氨基酸、1种碳水化合物）,41种血清代谢物（19种脂肪酸、8种有机酸、5种氨基酸、4种胆汁酸、1种肉碱、1种碳水化合物、2种苯环类化合物、1种苯丙酸）,17种肝组织代谢物（4种脂肪酸、3种胆汁酸、3种有机酸、3种肉碱、3种氨基酸、1种苯环类化合物）,5种白色脂肪代谢物（1种脂肪酸、2种有机酸、1种碳水化合物、1种苯丙酸）,20种棕色脂肪代谢物（14种脂肪酸、3种有机酸、3种氨基酸）,17种脑组织代谢物（9种脂肪酸、3种胆汁酸、2种氨基酸、2种碳水化合物、1种肉碱）浓度。5.通过肠道菌群与代谢物相关性分析发现MAFLD小鼠肠道菌寻常拟杆菌（Bacteroidesvulgatus）丰度与肠道内容物代谢物棕榈油酸（Palmitoleic acid）浓度呈显著正相关;产酸拟杆菌（B acteroidesacidifaciens）丰度与肠道内容物代谢物棕榈油酸（Palmitoleic acid）浓度呈正相关,与异丁酸（Isobutyric acid）、丙酸（Propanoic acid）浓度呈负相关;肠道菌群肠道内容物与血清生化指标相关性分析发现Bacteroidesvulgatus与TG、TCH呈显著正相关,与HDL-c呈负相关。6.与正常小鼠比较,模型小鼠肝组织胆汁酸转运体BSEP、OATP4a1蛋白表达降低,NTCP、MRP3、MRP4蛋白表达升高。茵陈蒿汤及其组分绿原酸、大黄多糖、没食子酸、栀子苷以及组分复方能够显著升高模型小鼠肝组织BSEP蛋白表达。茵陈蒿汤及其组分没食子酸、栀子苷以及组分复方能够显著降低模型小鼠肝组织NTCP蛋白表达。茵陈蒿汤及其组分绿原酸、大黄多糖、没食子酸、组分复方能够显著升高模型小鼠肝组织OATP4a1蛋白表达。绿原酸、大黄多糖、组分复方能够显著降低模型小鼠肝组织MRP3、MRP4蛋白表达。7.与正常小鼠比较,模型小鼠肝组织脂肪酸合成关键转录因子SREBP-1c、ChREBP及其靶基因ACC1、FAS蛋白表达升高,脂肪酸转运和氧化的重要因子CD36蛋白表达升高,催化饱和脂肪酸转化为单不饱和脂肪酸的限速酶SCD1蛋白表达降低。茵陈蒿汤及其组分绿原酸、大黄多糖、没食子酸、栀子苷以及组分复方能够降低模型小鼠肝组织SREBP-1c、CD36蛋白表达。绿原酸、大黄多糖及组分复方能够降低模型小鼠肝组织FAS及ACC1蛋白表达。绿原酸、没食子酸、栀子苷、组分复方及茵陈蒿汤能够升高模型小鼠肝组织SCD1蛋白表达。大黄多糖、栀子苷能够降低模型小鼠肝组织ChREBP蛋白表达。没食子酸、组分方法、茵陈蒿汤能够进一步升高模型小鼠肝组织ChREBP蛋白表达。8.与正常小鼠比较,模型小鼠肝组织FXR、SHP蛋白表达显著降低,LXR-alpha蛋白表达显著升高。茵陈蒿汤及其组分绿原酸、大黄多糖、没食子酸、栀子苷以及组分复方能够升高模型小鼠肝组织FXR及SHP蛋白表达,绿原酸、大黄多糖能够显著降低模型小鼠肝组织LXR-alpha蛋白表达。没食子酸、栀子苷、组分复方及茵陈蒿汤对LXR-alpha未见显著调控作用。结论:1.寻常拟杆菌（Bacteroidesvulgatus）是MAFLD疾病进展的重要菌种。茵陈蒿汤及其组分绿原酸、大黄多糖、没食子酸、栀子苷均可显著降低寻常拟杆菌丰度。其中大黄多糖作用最为显著。2.脂肪酸、有机酸、胆汁酸、氨基酸代谢紊乱是MAFLD代谢表型的主要特征。棕榈油酸是MAFLD代谢紊乱的生物标记物。茵陈蒿汤及其组分绿原酸、大黄多糖、没食子酸、栀子苷均可显著降低肝组织棕榈油酸浓度,改善MAFLD代谢紊乱状态。其中大黄多糖作用最为显著。3.茵陈蒿汤及其组分复方能够升高肝组织FXR/SHP,降低肝组织SREBP-1c、CD36蛋白表达,改善MAFLD脂肪酸、胆汁酸代谢。其中,绿原酸、大黄多糖通过调控肝组织FXR/SHP/LXR-alpha信号通路,抑制胆汁酸合成,促进胆汁酸排泄,减少脂肪生成,加速脂肪酸氧化代谢,是其治疗MAFLD的主要效应机制。栀子苷促进肝组织FXR表达,抑制胆汁酸合成,改变胆酸池组成,减少胆汁酸从肝血窦面摄入,降低肝细胞内脂肪酸蓄积,促进饱和脂肪酸转换为单不饱和脂肪酸,减轻肝损伤,是其治疗MAFLD的主要效应机制。4.没食子酸能够进一步升高MAFLD肝组织ChREBP蛋白表达,对肠道菌群及各组织脂肪酸代谢改善作用不显著,是减弱组分复方疗效的重要原因。