家禽是人类重要的动物蛋白来源,提高家禽的饲料转化效率和生长速度,是家禽养殖业者和畜牧科技人员不断探索追求的目标。生长分化因子8(GDF8,又名MSTN)高度表达于动物肌肉组织中,是骨骼肌生长发育的负调控因子。GDF8基因突变可引起动物的“双肌”表型,因此,利用生物技术对GDF8基因进行调控,是提高经济动物的产肉性能和生长速度的一个策略。在本研究中,我们借助CRISPR/Cas9基因编辑技术,探索适合家禽基因组的编辑策略,研制GDF8基因缺陷的转基因生殖系嵌合体鸡。首先,为了解鸡GDF8基因进化特征及其功能,我们对禽类和哺乳类GDF8基因序列进行同源性分析。分析结果显示,GDF8基因在各物种间进化保守,推测禽类与哺乳动物的GDF8基因行使相同的功能。对鸡GDF8基因进行功能富集分析也表明,鸡GDF8基因功能与哺乳动物一样主要是机体创伤后损伤修复。利用定量PCR对鸡胚中不同组织的GDF8基因表达情况鉴定发现,GDF8基因高表达于腿和胸等肌肉组织中,证实了鸡GDF8基因与骨骼肌生长发育是密切相关的。第二,为在家禽细胞中实现对GDF8基因高效率的编辑,我们对CRISPR/Cas9系统进行了优化。本研究针对GDF8基因1号外显子设计了4条sg RNA,将其构建到PX459质粒上,并转染DF-1细胞进行基因敲除。通过T7E1连接酶检测发现,所构建的4个PX459-sg RNA质粒都能实现GDF8基因敲除,其中PX459-sg RNA2敲除效率最高。为探索更高的敲除效果,本研究将3个sg RNA组合到同一质粒-PX459-multisg RNA,经过验证,PX459-multisg RNA质粒在DF-1和原始生殖细胞(PGCs)上都取得比单个sg RNA更好的敲除效果。通过挑取单个阳性细胞进行PCR测序,表明PX459-multisg RNA可以对鸡GDF8基因造成大片段缺失的基因敲除效果。第三,为便于追踪GDF8突变鸡的制备,本研究采用定点插入m Cherry荧光报告基因的方式实现对GDF8基因敲除。首先,我们比较了HMEJ(同源介导的末端加入)、HR(同源直接修复)和HITI同源独立的靶向整合)三种基因整合策略,对CRISPR/Cas9介导的基因定点整合方法进行优化。通过将GDF8-HMEJ、GDF8-HDR和GDF8-HITI三种供体质粒分别与Cas9-sg RNA2共转染到DF-1细胞,在转染15天后,对三组策略的阳性细胞的PCR结果显示三种策略均能实现基因定点整合,同时通过流式细胞仪检测三组m Cherry~+细胞比例分别为:HMEJ组13.75%、HDR组2.14%的和HITI组的1.23%,这表明HMEJ策略比HR和HITI的整合效率更高。最后,我们利用PGC细胞介导法制备GDF8敲除鸡。通过将GDF8-HMEJ质粒和Cas9-sg RNA2质粒共转染鸡原代PGCs,而后通过两次流式细胞仪分选获得m Cherry~+PGCs。通过鸡胚注射将GDF8突变的m Cherry~+PGCs注射到发育至H15期的受体鸡胚。对注射后7天的受体鸡胚性腺进行解剖,可以观察到左右性腺存在大量的m Cherry~+细胞,这表明本研究成功制备了GDF8基因突变的生殖系嵌合体鸡胚胎。通过将嵌合体鸡胚继续孵化,我们最终获得了7只小鸡。综上所述,本研究证明多sg RNA介导的CRISPR/Cas9技术可对鸡GDF8基因造成大片段缺失的敲除效果。同时研究通过HMEJ整合策略构建了定点插入GDF8基因一号外显子的供体质粒,并初步应用于PGC法介导的转基因鸡的制备获得GDF8突变的生殖系嵌合体鸡。研究结果为研究GDF8基因在为改善肉质和提升生长性能中的作用及新品种培育奠定了基础。