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目的:本研究旨在了解多粘菌素B在我国临床应用前,碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌（Carbapenem-Resistant Enterobacteriacea,CRE）耐受多粘菌素B的流行现状、分子机制以及传播机制。为采取合理的用药方案,遏制此类菌株的持续感染和暴发流行提供参考依据。方法:1.菌株及相关临床信息收集:收集2016年10月至2017年9月我国六个不同城市六家三级甲等医院分离的非重复CRE菌株,同时从病历中收集临床数据。2.菌株鉴定和药敏试验:所有CRE菌株用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry,MALDI-TOF MS）进行鉴定。使用微量肉汤稀释法测定多粘菌素B的最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration,MIC）。对于多粘菌素B耐药CRE（polymyxin B resistance CRE,PR-CRE）菌株,常用临床抗菌药物的体外药敏试验由Phoenix 100自动微生物系统进行评估。3.PR-CRE菌株分子特征研究:通过PCR扩增技术、Sanger测序检测、脉冲场凝胶电泳（pulsed-field gel electrophoresis,PFGE）和多位点序列分型（multilocus sequence typing,MLST）研究PR-CRE菌株的分子特征。4.CRE耐受多粘菌素B的机制研究:采用PCR扩增技术、Sanger测序和实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR,RT-q PCR）研究多粘菌素B耐药的分子机制。5.mcr-1的可转移性及适应性代价研究:通过接合转移频率试验计算mcr-1阳性质粒p MCR1＿Inc X4和p MCR1＿Inc I2（实验室前期研究所得）发生接合转移的频率。通过连续传代培养,检测这两种质粒的稳定性。通过测定生长曲线、体外竞争实验、大蜡螟模型研究mcr-1阳性质粒p MCR1＿Inc X4和p MCR1＿Inc I2的适应性代价。结果:1.在本研究中,所有病人均未使用多粘菌素治疗,约3.8%（19/504）的CRE菌株对多粘菌素B耐药,包括13株肺炎克雷伯菌、2株大肠埃希菌、2株产气克雷伯菌和2株阴沟肠杆菌。不同地区CRE对多粘菌素B的耐药率略有差异。2.19株PR-CRE菌株表现出多重耐药,对临床大多数常用抗菌药物耐药率达到70%以上,但对替加环素的耐药率较低（5.3%）。所有PR-CRE菌株均携带编码碳青霉烯酶的基因,主要为blaNDM（68.4%）,其次是blaKPC（21.1%）和blaIMP（10.5%）。其中,15株菌同时携带编码ESBLs的基因,2株菌同时携带编码Amp C酶的基因,2株菌同时携带编码ESBLs和Amp C酶的基因。3.PFGE和MLST分析显示,19株PR-CRE中,13株肺炎克雷伯菌属于3个不同的STs,以ST48为主（n=8）。8株ST48型肺炎克雷伯菌均来自成都,且同源性大于90%,提示可能存在小范围克隆传播。2株产气克雷伯菌为ST14型,同源性大于90%,2株大肠埃希菌和2株阴沟肠杆菌分别属于不同ST型。4.19株PR-CRE中,大肠埃希菌中检测出了mcr-1基因（2/2）;肺炎克雷伯菌中检测出了mgr B的插入序列（IS）（3/13）、终止密码子（1/13）、完全缺失（2/13）以及pmr B错义突变（T159P）（1/13）;阴沟肠杆菌中检测到mgr B移码突变（1/2）。进一步的转录分析表明,pmr A、pmr B、pmr C、pmr K和pho Q在肺炎克雷伯菌中表达显著上调,pmr A、pmr B、pmr C和pmr K在阴沟肠杆菌和产气克雷伯菌中表达显著上调。5.mcr-1阳性质粒p MCR1＿Inc X4和p MCR1＿Inc I2接合转移的频率分别为4.46×10-5和7.81×10-5。在无多粘菌素B的情况下,细菌传代200代后p MCR1＿Inc X4的携带率为84.33%±3.51以上,p MCR1＿Inc I2的携带率为88.33%±4.73以上。6、接合子Inc X4-mcr-1-E600、Inc I2-mcr-1-E600与E.coli E600在10h以内各时间点的OD值无统计学差异（P>0.05）。体外竞争试验显示,Inc X4-mcr-1-E600的竞争指数（competition index,CI）为0.99±0.03,Inc I2-mcr-1-E600的CI为0.98±0.03,均未出现明显的适应性改变。与生理盐水组比较,3组大蜡螟幼虫的生存率均表现不同程度的下降,但生存曲线无统计学差异（Log-rank P=0.9131）。结论:1.在没有使用过多粘菌素B的情况下,有3.8%的CRE菌株对多粘菌素B耐药。提示临床医生应警惕多粘菌素B耐药性的存在,并在药敏结果的指导下合理用药,避免多粘菌素B耐药菌株的进一步传播。2.临床CRE菌株对多粘菌素B的耐药性主要由染色体和质粒介导。所有PR-CRE菌株pmr A、pmr B、pmr C、pmr K表达均增加,表明它们可能都通过脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）修饰,赋予了多粘菌素B抗性。3.携带mcr-1的质粒p MCR1＿Inc X4和p MCR1＿Inc I2具有可转移性和高稳定性,并且对E.coli E600未产生适应性代价,更有利于mcr-1耐药基因在自然界中的长期存在,可能会引起暴发性传播。