致病菌每年造成数以百万计的感染,极大危害了人类健康。因此,开发简便、快速、高灵敏致病菌检测技术十分迫切。在目前的细菌检测技术中,生物传感因其小型化、低能耗、集成化等诸多优势而受到广泛关注。环状功能核酸具有高生物稳定性、热稳定性、以及能够以滚环扩增的方式合成DNA进行信号放大,在生物传感领域得到了广泛应用。环状功能核酸的制备通常是通过典型的酶介导的连接反应。然而,由于线性功能核酸自身复杂的三级结构以及连接酶较差的选择性,使得环状功能核酸的高效制备比较困难。据此,本研究提出一个策略来克服此问题,首先使用体外筛选技术从随机DNA文库寻找特异性结合最常用的T4 DNA连接酶的适配体,然后通过合理设计将适配体转化成通用模板支架以“指导”连接酶执行分子内选择性环化。后续利用该模板支架合成了环状RNA切割型脱氧核酶探针用于大肠杆菌E.coli生物传感,合成了环状适配体分子开关用于艰难梭菌C.difficile毒素B的高灵敏度和高选择性的直接传感,合成了基于环状G-四链体/NMM脱氧核酶的嗜热荧光传感器,以实现致病菌单核苷酸多态性的检测。本论文的具体内容如下:1.体外筛选T4 DNA连接酶特异性适配体。对第14轮的扩增产物进行高通量测序,结果表明序列DAS1富集率可达24%,并且可以高效自环化。对其二级结构进行预测和解析后,发现SS1和J2/3之间的相互作用是环状DNA产率和选择性显著提高的主要原因。此外,荧光各向异性实验表明T4DL对DAS1具有高亲和力。综上所述,DAS1已经成功进化为T4DL的最佳环化底物,同时作为具有特定结构的T4DL特异性适配体。2.高效制备环状脱氧核酶探针CEC1用于E.coli传感。利用模板支架TDS1.T1高效制备了CEC1,其在细菌裂解液中具有高生物稳定性:1小时内,LEC1的降解率高达90%,而CEC1仅损失13%,并且CEC1仍具有识别E.coli剪切RNA的功能。此外,本研究考察了不进行培养的情况下,该探针对E.coli的检测性能:检出限为10~3CFU/m L,并且针对随机选取的其他细菌,均不能激活CEC1切割RDS,表明了高选择性。最后,针对临床样本的分析表明,该探针具有巨大的临床应用潜力。3.开发C.difficile毒素B蛋白响应的分子开关MR-toxin B。将抗毒素B的适配体Dapt1借助一个弱化的桥联元件与TDS1进行耦合。分子开关MR-toxin B.4在没有毒素B的存在下,产生的环化率可以忽略不计,但在添加毒素B后,其环化率可达45%,并且随着毒素B浓度的增加,环状产物的数量逐渐增加。此外,针对非靶标,未观察到明显的环状产物。最后,考察了利用RCA对毒素B进行定量分析的可行性:30 min内可达到0.1 n M的检测限。4.将热稳定信号转导单元与等温扩增反应相结合,开发了一种嗜热荧光分析方法。高温可保证碱基配对的准确性。基于此,该荧光检测方法已成功应用于鉴定DNA上一个或两个错配碱基。该方法有望广泛应用于其他序列的SNP鉴定,如耐药菌基因。此外,该工作使热稳定的G-四链体在生物传感器领域具有广阔的应用前景。