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电离辐射造成的DNA双链损伤(DNA double-strand breaks, DSBs),通常经过以下两个通路修复：同源重组修复(homologous recombination repair, HRR),非同源末端连接修复(non-homologous end-joining, NHEJ),其中非同源末端连接修复通路又分为经典的非同源末端连接(classical non-homologous end-joining, C-NHEJ)和选择性非同源末端连接(Alternative non-homologous end-joining, alt-NHEJ)。本研究着重探讨了高能重粒子(high charged and energy (HZE) particles)辐射对DNA非同源末端连接模式的影响。本研究通过系列实验,测试经过高能重粒子辐射后,定点诱导的DNA双链断裂的非同源末端连接模式的改变。应用了一个三色荧光标记的报告细胞体系DsR-7F4,该细胞系来源于人类膀胱癌细胞EJ-30,其中两个单拷贝报告子序列分别整合于两个不同的染色体中。报告子一的结构从5’末端到3’末端依次为：启动子,I-SceI识别位点,含有终止密码子的嘌呤霉素编码序列,I-SceI识别位点,eGFP绿色荧光蛋白编码序列；报告子二只含有一个完整的无启动子的DsRed红色荧光蛋白编码序列,在其5’末端含有一个I-SceI识别位点；核酸内切酶I-SceI通过慢病毒载体导入报告细胞中,在I-SceI识别位点诱导特异性的DNA双链断裂,载体中包括一个IFP红外荧光蛋白用来监测细胞中I-SceI的表达水平。如果报告子一中的同染色体两个远端I-SceI断端互相连接,造成中间嘌呤霉素片段的缺失,则细胞激活表达eGFP绿色荧光蛋白；如果报告子一中的启动子3’端I-SceI末端通过染色体转位作用与报告子二中DsRed5’端的I-SceI互补末端连接,则会激活DsRed红色荧光蛋白表达。经典的非同源末端连接通路(C-NHEJ)会优先连接邻近的DNA断端,因此在报告细胞中荧光蛋白表达阳性的细胞通常较低,如果荧光蛋白的表达细胞阳性率发生改变,则说明：1.发生了同染色体上两远端断点连接,导致其中间片段的缺失(eGFP表达),2.发生了不同染色体间转位连接(DsRed表达),本研究中称之为错误的非同源末端连接修复表型(mutagenic repair phenotype)。报告细胞经过0Gy,0.3Gy和1.0Gy的600MeV/u Fe粒子照射处理或同剂量的320kV X射线处理后,在细胞恢复1,7,14,21,28天(高能重粒子辐射组)或1天和7天(x射线辐射组)后,通过慢病毒载体系统引入I-SceI核酸内切酶,应用流式细胞技术(flow cytomety)来检测不同荧光蛋白表达的细胞阳性率的改变,通过单因素方差分析(ANOVA)来检测不同处理组间的区别。结果显示1.0Gy高能重粒子照射组相比0Gy对照组在1天,7天之后,其错误的非同源末端连接修复表型(同染色体远端连接或不同染色体间的转位连接)显著增加(P<0.05),而0.3Gy高能重粒子处理组和x射线处理组相比对照组在实验观察时间段内无统计学差异。本研究通过免疫荧光实验检测了照射细胞中γ-H2AX焦点恢复速度和细胞微核的形成,结果显示,高能重粒子对细胞基因组的长期损伤可持续14-21天,而经过同剂量X射线处理的细胞在7天之后恢复到正常水平。克隆形成细胞存活实验(clonogenic cell survival assay)显示,照射处理后细胞的存活分数(surviving fraction, SF)同剂量与线性能量转移率(linear energy transfer, LET)直接相关。对高能重粒子照射后7天的细胞样品的全基因组表达谱分析显示,部分分泌性细胞因子表达上调显著,提示细胞间通过分泌因子(secretome)的交流增强。为了更进一步了解高能重粒子辐射史对后续DNA损伤的非同源末端连接修复模式的影响,本研究通过抑制经典非同源末端连接通路中的重要上游因子DNA-PK的活性,建立了一个药理学模型,复制并放大了高能重粒子辐射引起的错误性DNA非同源末端连接表型,对选择性非同源末端连接通路因子Mrell蛋白的抑制则使错误性非同源末端连接率显著降低,提示选择性非同源末端连接通路可能在该过程中被激活或上调并发挥重要的作用。在发现了DNA-PK激酶活性抑制可以造成DNA错误性修复表型后,本研究进一步还探讨了DNA-PK活性抑制对正常相邻细胞的间接作用,与高能重粒子辐射后相似,实时定量PCR结果显示部分分泌蛋白表达增高,本实验将正常报告细胞与经过DNA-PK抑制剂处理后的细胞采用transwell系统共同培养三天后,正常细胞显著表达出错误性非同源末端连接修复表型,提示细胞间的相互作也对DNA双链损伤非同源末端连接修复通路具有一定影响。第一部分高能重粒子辐射的生物学效应[目的]探讨高能重粒子对报告细胞存活及生长的影响。[材料和方法]取对数生长期的报告细胞,进行不同剂量的高能重粒子辐照处理(0Gy,0.3Gy,1.0Gy)①检测不同剂量下细胞克隆存活率；②细胞周期分布改变；③细胞整体分裂速度。[结果]①细胞存活分数与辐照剂量及线性能量转移率(linear energy transfer,LET)相关,600MeV/u Fe粒子产生的相对生物学效应高于1000MeV/u Ti粒子与320kV X射线；②经过600MeV/u Fe粒子照射的细胞在1天后出现轻微G2期阻滞,随后在14-21天之后恢复；③1.0Gy高剂量组600MeV/u Fe粒子照射后的细胞相比对照组分裂减慢。[结论]高能重粒子辐射对细胞的影响与剂量与线性能量转移率密切相关,辐射质量影响相对生物学效应。第二部分高能重粒子辐照对DNA修复的影响[目的]探讨高能重粒子辐射对后续DNA双链损伤非同源末端连接修复模式的影响,分别比较相同染色体内远端连接和不同染色体间的转位效应(错误的DNA修复表型)。通过分析细胞中残余γ-H2AX焦点(foci)与细胞微核的形成来探讨高能重粒子辐射对真核细胞基因组稳定性的影响。[材料和方法]将报告细胞分别经过0Gy,0.3Gy和1.0Gy600MeV/u Fe粒子辐射处理后,分别检测恢复1,7,14,21,28天后错误性修复表型的发生率的改变。分析同剂量320kV x射线和和近似等效剂量的1Gy,3Gy γ射线处理组,观察1天及7天做为对照。基因组不稳定性(genome instability)检测通过将报告细胞系分别经过0Gy,0.3Gy和1.0Gy600MeV/u Fe粒子辐射处理后,分别检测恢复1,7,14,21天后残余γ-H2AX焦点数量和细胞微核数量。取同剂量320kV X射线处理组做为对照。在细胞经过相应辐照处理后,恢复相应时间,固定并用抗γ-H2AX和DAPI染色,每组计数100个细胞,统计细胞中所含γ-H2AX焦点数和是含有微核的细胞的比例。[结果]在1.0Gy高剂量高能重粒子处理组,错误性非同源末端连接修复表型增高持续7到14天,其中I-SceI介导同染色体远端连接增加持续14天,I-SceI介导的不同染色体转位连接增加持续7天后减弱,而X射线和γ射线则对该表型无显著影响。细胞中的残余γ-H2AX焦点数量随恢复时间与辐射的线性能量转移率而降低,特别是高能重粒子1.0Gy处理后恢复1天实验组中,检测到大量细胞中含有持续未修复的焦点。细胞微核的结果与残余γ-H2AX焦点数量恢复模式相似。[结论]本实验结果显示,高能重粒子辐射会对非同源末端连接模式在一定时间内(持续约14天)产生显著的影响,同时体现在显著的基因组不稳定生物标记(大量未修复的γ-H2AX焦点及细胞微核)增强,该影响依赖于辐射剂量与质量。第三部分高能重粒子辐射对基因组蛋白表达的影响[目的]检测高能重粒子辐射对细胞的整体影响。[材料和方法]取0Gy,0.3Gy,1.0Gy的高能重粒子辐照后恢复7天的样品,提取总RNA,反转录取得cDNA,通过芯片检测全基因组的表达谱。[结果]主要因子分析(principal components analysis, PCA)结果显示三个剂量组区别明显,部分细胞分泌蛋白随剂量增加显著,并通实时定量PCR得到验证。[结论]高能重粒子辐射对整个细胞基因表达谱产生影响,分泌因子增加提示细胞间交流增加。第四部分错误性DNA非同源末端连接表型的形成机制的探讨[目的]通过建立一个可调控的模型,模拟并放大高能重粒子辐射引起的错误性修复表型,并通过该模型进一步研究其机制。[材料和方法]通过抑制DNA-PK激酶活性,调控细胞中非同源末端连接的模式,检测其对同染色体远端连接及不同染色体转位的影响,同时采用另一个化学抑制剂,抑制选择性非同源末端连接的关键因子Mre11,检测其是否降低该错误性修复表型。因细胞中分泌蛋白的上调,本实验通过共培养(co-culture)对该处理引起间接作用进行探讨,利用DNA-PK抑制模型,将药物处理过的细胞与正常报告细胞通过Transwell系统共同培养,检测未经处理的报告细胞中的DNA双链损伤的非同源末端连接修复模式。[结果]DNA-PK抑制增加约4倍的同染色体远端连接,大于10倍的不同染色体转位,同时也检测到部分炎性及分泌因子的上调,而加入Mre11蛋白抑制剂后,错误性修复表型显著降低。DNA-PK处理细胞与正常细胞的共同培养,在正常细中检测到同染色体上远端连接率提高大约2-3倍,不同染色体间的转位连接率增加幅度与前者类似。[结论]该模型成功的模拟并放大了高能重粒子的效应,而抑制了选择性非同源末端连接通路后,该效应显著降低,提示了选择性非同源末端连接可能在该过程中起到一定作用。高能重粒子引起的损伤在对靶细胞直接作用的同时,靶细胞会通过分泌的炎性因子等传递相同的信息到相邻正常细胞,从而且使这种错误性非同源末端连接修复表型得到传播。