目的:在所有肿瘤中,胰腺癌的5年生存率最低,仅为9%。其中胰腺导管腺癌(Pancreatic Ductal Adenocarcinoma,PDAC)占所有胰腺肿瘤的90%以上,预后不良,其1年生存率约为18%。术后有效的辅助化疗方案极其有限且效果并不理想。同时,在临床工作中我们发现,即便化疗方案相同、肿瘤分期相同的患者,预后也不尽相同。因此,如何改善可切除胰腺癌患者的预后,选取针对患者个体化的辅助治疗手段,对疗效的准确评估显的至关重要。影响胰腺癌预后不良的原因之一是胰腺癌细胞具有很强的增殖能力。广泛的预后因素与增殖有关,既往关于胰腺癌增殖的研究主要集中在蛋白水平,基因水平研究缺乏。MicroRNA(miRNA)是非编码的小RNA,长度为20-23个核苷酸。通过特异性结合靶mRNA的3’-未翻译区(3’-UTR),导致靶mRNA降解或翻译抑制进而影响细胞增殖。单一miRNA可以靶向成百上千个不同的mRNA,并且同一mRNA可以被多个不同的miRNA协同抑制,因此,miRNA的生物生成及调控在基因调控网络中具有重要作用。由于其稳定性高、体积小、组织特异性强、分离简单,与mRNA和蛋白质相比,miRNA更适合作为预测预后的生物标志物。Cbl-b是CBL(Casitas B-lineage lymphoma)基因编码的具有E3泛素连接酶和接头蛋白功能的CBL家族成员之一。在免疫系统中,Cbl-b以细胞固有方式阻碍效应器CD8~+T细胞反应,以Cbl-b为靶点可增强易感患者对系统性真菌感染的免疫力。在实体肿瘤中,Cbl-b的功能存在争议。既往关于Cbl-b在肿瘤的研究主要集中在胃癌、乳腺癌和非小细胞肺癌中,但Cbl-b和PDAC之间的关系报道较少。Yes相关蛋白(Yes-associated protein,YAP),是Hippo信号通路的核心元件,参与细胞增殖和组织再生过程。在其他恶性肿瘤如肝癌、卵巢癌、非小细胞肺癌中,YAP也相继表达呈升高状态。YAP可以通过引起上皮-间充质转变,失去接触抑制来促进肿瘤的恶性转化,YAP的激活还可以增强癌细胞的迁移能力进而降低肿瘤细胞对治疗的敏感性。YAP是如何影响PDAC增殖的机制目前还需要进一步研究。本研究随机选取部分临床病理因素及治疗手段相似而预后截然不同的病例(各10例),分为预后好及预后差两组,将两组进行miRNA表达谱的检测,比较两组差异表达的miRNA,筛选有意义miRNA。在独立大样本量验证病例组患者组织标本中验证差异表达miRNA的预后意义。结果表明,在可切除胰腺癌中miR-29b-2-5p是一个良好的独立预后因子。此外,miR-29b-2-5p负性调节Cbl-b和YAP,降低Cbl-b介导的泛素化和p53的表达,抑制PDAC细胞的增殖,我们同时发现ECT2表达受YAP调节,ECT2上调与胰腺癌进展相关,并且ECT2通过YAP在胰腺癌细胞生长和转移中起关键作用。这些将为研究胰腺癌发生、发展、侵袭转移的作用机制及探索胰腺癌治疗的新靶点提供理论基础。材料与方法:1.收集中国医科大学附属盛京医院2009年1月至2011年2月经手术治疗的原发性PDAC患者,根据入选及排除标准,最终共120例入选。2.利用临床分析手段确定筛选病例组(预后好组10例,预后差组10例)及验证病例组(n=100)。3.miRNeasy FFPE Kit试剂盒提取FFPE组织标本的包括miRNAs在内的总RNA。4.采用GenoExplorerTM microRNA array检测筛选病例组miRNA表达。5.细胞培养,人PDAC细胞系SW1990和CaPan-2为本实验室常规传代培养。6.细胞转染,细胞过表达miR-29b-2-5p:广州锐博公司合成的miRNA mimic,转染试剂Lipofectamine 2000,上海GeneChem公司合成的Cbl-b、YAP siRNA:转染siRNA和阴性对照NC。7.使用Trizol对细胞RNA的提取。8.台盼蓝据染计数法测定细胞增殖能力。9.Western blot检测Cbl-b、EGFR、BBRCA1、p53、磷酸化p53、GAPDH、YAP、ECT2等蛋白的表达。10.采用RT-PCR方法检测Cbl-b、YAP、ECT2、CTGF、CYR61等mRNA的表达。11.双荧光素酶报告基因实验进行靶基因鉴定及验证蛋白之间的结合。12.采用免疫组化染色检测PDAC组织标本中Cbl-b、Ki-67或ECT2的表达情况。13.采用免疫荧光技术检测PDAC组织标本中Cbl-b、p53或Ki67、ECT2的表达情况。14.采用Crispr Cas-9技术在人和鼠PDAC细胞系例敲除ECT2的表达。15.采用小鼠活体成像技术检测鼠胰腺中ECT2的生长和肝中ECT2的转移情况。16.统计学分析,miRNA的表达水平与病例临床病理特征之间的组间比较应用卡方检验或Fisher确切概率法。应用Kaplan-Meier法进行单因素生存分析,应用Kaplan-Meier法绘制生存曲线,生存差异应用Log-rank进行检验。多因素生存分析采用多因素Cox比例风险模型(前进法)。应用SPSS13.0软件进行统计分析,以P<0.05为差异具有统计学意义。结果:1.筛选病例组及验证病例组患者特征:筛选病例组:预后好组及预后差组各10例,两组病例间的临床病理因素基本均衡(均P>0.05),验证病例组:100例包含各分期的可切除PDAC患者,其临床病理因素与筛选病例组无显著差异;2.miRNAs表达芯片检测筛选病例组miRNA表达谱:预后好组与预后差组间共有30个miRNAs的表达存在差异显著(P<0.05),与预后差组比较,预后好组有22个miRNA表达显著上调(miR-29b-2-5p等),8个miRNA显著下调(miR-152等);3.验证miR-29b-2-5p的预后意义:在20例筛选集中和40例癌和癌旁的胰腺癌患者中发现miR-29b-2-5p在预后好和癌旁组织中表达分别高于预后差和肿瘤组织,100例验证集中以中为生存时间为中间点分为预后好与不好两组,发现miR-29b-2-5p在预后好中表达较高,初步确认miR-29b-2-5p是可切除PDAC患者的预后标志物;4.miR-29b-2-5p与患者临床病理特征的关系:miR-29b-2-5p在可切除PDAC患者中表达水平与患者的性别、分化、手术边缘、pT分期、pN分期、脉管瘤栓、临近组织侵袭及CA19-9有关(均P<0.05),而与其他各临床病理特征均无关(均P>0.05);5.多因素生存分析验证miR-29b-2-5p的预后意义:miR-29b-2-5p高表达(HR,0.492;95%CI,0.300-0.807;P=0.005)是可手术切除的PDAC患者总生存期长的独立预测因子;6.细胞实验验证miR-29b-2-5p抑制胰腺癌细胞的增殖;7.裸鼠实验验证miR-29b-2-5p抑制制胰腺癌细胞的增殖;8.miR-29b-2-5p可以诱导PDAC细胞凋亡和G1期细胞周期停滞:流式细胞术检测细胞周期和凋亡发现miR-29b-2-5p过表达可以显著使PDAC细胞在G1期停滞并促进PDAC的凋亡,过表达miR-29b-2-5p后Bcl-2,CyclinD1表达降低,Bax表达升高;9.miR-29b-2-5p靶基因的预测和验证:miR-29b-2-5p可以显著抑制Cbl-b和YAP的表达,BRCA1、EGFR、IGFR表达没有变化;在PDAC细胞中miR-29b-2-5p能够以浓度依赖的方式显著下调Cbl-b的蛋白表达水平而mRNA表达水平并无显著影响,双荧光报告激酶实验显示,miR-29b-2-5p可以通过结合位点直接靶向抑制Cbl-b和YAP的表达。10.过表达Cbl-b促进PDAC细胞的增殖,而且这种增殖依赖于miR-29b-2-5p:敲除Cbl-b能够显著抑制PDAC细胞的增殖能力,Cbl-b通过miR-29b-2-5p促进PDAC细胞的增殖;11.miR-29b-2-5p通过抑制Cbl-b促进p53的表达Cbl-b结合p53并在细胞存在共定位,并且Cbl-b可以泛素化降解p53:在SW1990细胞系中分别沉默Cbl-b和过表达Cbl-b,我们发现p53、p-p53表达均呈相反变化,发现在使用PS341后,比较未处理组Ub蛋白表达增多,证明Cbl-b通过泛素化降解p53蛋白免疫荧光实验观察Cbl-b与p53表达,发现二者存在共定位,而且荧光显示miR-29b-2-5p通过抑制Cbl-b表达促进p53表达;12.在验证集中Cbl-b与预后和miR-29b-2-5p的表达呈负相关:Spearman等级相关分析表明Cbl-b的表达与miR-29b-2-5p的表达呈显著负相关,r=-0.33,p=0.001;13.YAP促进ECT2的表达:YAP的敲除可以显著降低Mia PaCa-2或Aspc1胰腺癌细胞系中的ECT2蛋白水平,YAP抑制剂维替泊芬verteporfin也可以降低ECT2蛋白表达水平,我们进行染色质免疫沉淀(CHIP)实验以确定是否在ECT2启动子区域发现与YAP的结合;14.ECT2上调促进胰腺癌进展:在更大的样本量下,我们使用公开可用的微阵列数据集Oncomine分析数据库进行了肿瘤学分析,发现在PDAC中的ECT2 mRNA水平比正常胰腺中的要高;ECT2的上调,特别是其在细胞核中的存在,与人类PDAC的进展和转移有关。通过免疫组化,我们发现在KC小鼠的小部分PANIN细胞和在KPC小鼠的胰腺癌细胞中可以检测到核ECT2;15.ECT2促进胰腺癌增殖:我们通过免疫荧光染色,发现ECT2在细胞核中的定位经常与Ki-67阳性细胞相关,采用CRISPR-CAS9方法来降低胰腺癌细胞系中的ECT2表达,ECT2表达缺失抑制了癌细胞的增殖;16.ECT2敲除后信号通路改变:ECT2表达的降低主要影响PI-3激酶和STAT3信号通路,而不是MAP激酶通路;17.YAP与ECT2参与细胞因子的调节:在ECT2-KO细胞中,IL11和IL6的mRNA水平显著降低,同样,Yap的敲除也导致了IL11和IL6的mRNA水平的降低,敲除ECT2后只导致YAP表达的适度降低;18.ECT2在胰腺癌细胞迁移中起着关键作用:使用Transwell分析,我们发现胰腺癌细胞的迁移在ECT2基因敲除后减少;19.动物实验验证ECT2参与了胰腺癌细胞的增殖和转移:从KPC小鼠中分离得到的小鼠胰腺癌细胞系4662细胞被转染以稳定表达萤火虫荧光素酶,敲除ECT2抑制了PDAC细胞的增殖和迁移。结论:1、miR-29b-2-5p是可切除PDAC患者的独立预后因子。2、miR-29b-2-5p通过促进G1期阻滞、诱导细胞凋亡抑制PDAC细胞的增殖。3、miR-29b-2-5p通过抑制Cbl-b表达,减少Cbl-b介导的p53泛素化和降解,进而抑制PDAC细胞的增殖能力。4、miR-29b-2-5p抑制YAP表达。5、YAP通过与ECT2启动子区结合促进胰腺癌增殖和转移。6、ECT2反馈性上调YAP,进一步促进胰腺癌进展。