【摘 要】
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目的:人骨髓间充质干细胞(Human bone marrow mesenchymal stem cells,h MSCs)在近年来受到广泛关注,KLF2是胚胎干细胞(h ESCs)增殖分化相关的转录因子,已有报道其在维持ESCs
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目的:人骨髓间充质干细胞(Human bone marrow mesenchymal stem cells,h MSCs)在近年来受到广泛关注,KLF2是胚胎干细胞(h ESCs)增殖分化相关的转录因子,已有报道其在维持ESCs自我更新及增殖分化能力方面具有重要作用。在间充质干细胞(MSCs)中也有报导KLF2参与了自我更新及增殖上的表达过程,但KLF2在h MSCs中的作用机制尚不清楚。本研究探索了KLF2对h MSCs干性维持的作用及其与相关基因FGFR3调控的分子机制,为MSCs在组织工程及临床应用上的转化提供指导意义。方法:对2014年12月-2019年12月在浙江大学医学院附属第一医院中自愿捐赠骨髓的患者中进行骨髓间充质干细胞的提取。在骨髓间充质干细胞进行原代培养后,经过RNA小干扰敲除掉FGFR3基因处理后,通过RT-PCR先进行了敲除效率的验证,利用RT-PCR进行了相关干性基因(NANOG、OCT4、SOX2、REX1)以及分化相关基因(ALP、SOX9、PPAR-γ2)的检测,用来证明在干性及分化中两者是否具有关联性。利用细胞克隆形成实验检测了细胞的增殖活性与繁殖能力。也通过蛋白免疫共沉淀技术(chromatin immunoprecipitation assay,CHIP)检测了KLF2转录因子是否能在FGFR3基因启动子片段进行直接调控。结果:在前期研究中,我们发现当我们用小干扰RNA敲除KLF2转录因子之后,靶基因FGFR3的表达也出现了明显的下调,具有趋同性;接着我们敲除了靶基因FGFR3,通过RT-PCR验证了它的敲除效率,结果显示FGFR3的表达具有明显下调;敲除FGFR3基因后,干性相关基因(Nanog、Oct4、Sox2、Rex1)的表达相较于Mock组均有明显的下降;而分化相关基因中只有ALP和SOX9的表达出现了上调。细胞克隆形成试验的结果显示FGFR3敲除组的细胞增殖能力相较于Mock组有明显的下降;从CHIP-sequence的结果中我们可以发现KLF2更容易与第二组及第四组的FGFR3启动子片段相结合,而且都具有比较高的结合率,在某种条件下KLF2转录因子会通过与FGFR3的直接结合从而影响间充质干细胞的干性及增殖能力。结论:KLF2转录因子可以通过调节FGFR3基因的表达促进人骨髓间充质干细胞的干性及增殖能力。
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